亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定干旱脅迫前后玉米幼苗的總黃酮含量

任園宇，魏東偉，王中偉，周亞萍

（河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002）

0 引言

玉米是中國重要的糧食、飼料、工業原料和藥物原料[1]。近年來，玉米種植地的干旱加劇，對玉米生產造成嚴重威脅。研究表明，玉米在生長發育過程中對水分的需求量大，苗期玉米對水分最敏感，此時遭受干旱脅迫，可造成玉米幼苗生長緩慢、成活率低，直接影響后期生長發育[2-3]。因此，研究干旱脅迫對玉米生理生化的影響，對保障玉米生產安全有重要意義。干旱、低溫、高鹽等逆境會造成植物細胞內自由基累積，使自由基的產生與清除平衡遭到破壞，積累的自由基會損傷膜的選擇透性[4]，攻擊細胞的脂質、DNA 和蛋白質，導致代謝異常[5]，最終影響植物正常生長發育。

黃酮類化合物是植物體內一類重要的具有抗氧化活性的次生代謝產物[6-7]，其基本骨架上的羥基取代基具有自由基清除活性，主要是通過電離出氫原子、中和氧自由基，并且與已經電離的黃酮類化合物結合成二聚體，防止逆向結合而清除自由基[8-9]。因此，黃酮類化合物能有效減緩干旱脅迫引起的自由基積累?，F有研究表明，干旱脅迫能刺激植物體內次生代謝產物的產生與積累[10]。一定的干旱脅迫會引起植物葉片黃酮類化合物含量的變化[11-12]。因此，總黃酮含量可以作為評估玉米耐旱性的生理指標之一。

目前測定總黃酮含量的方法主要有紫外直接測定法、三氯化鋁比色法和亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法。其中，亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法因精密度高、穩定性好、重現性好，被廣泛應用[13]。本研究采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法來測定干旱脅迫前后玉米幼苗葉片總黃酮含量的變化，以期為研究干旱脅迫條件下玉米次生代謝產物總黃酮含量的變化和耐旱性品種的篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 玉米籽粒 選取‘浚單20’、‘鄭單958’、‘豫玉22’的玉米籽粒，其中‘浚單20’購自北京屯玉種業有限責任公司、‘鄭單958’購自鄭州秋樂種業有限公司、‘豫玉22’購自襄陽正大種業開發有限公司。

1.1.2 試劑 蘆丁標準品（批號A0325409，北京伊諾凱科技有限公司），含量≥97%；無水乙醇（Ethanol，批號XK 13-011-00034），購自天津市富宇精細化工有限公司；亞 硝 酸 鈉（NaNO2，批 號20080422）、硝 酸 鋁（Al(NO3)3，批號20160919），均購自天津市華東試劑廠；氫氧化鈉（NaOH，批號20121027），購自天津達森化工產品銷售有限公司；聚乙二醇6000（PEG6000，批號Q/12HB 3891-2017），購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器 UV-2600 紫外-可見分光光度計（日本SHIMADZU 公司）；DK-S22 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏試驗室）；珠江牌光照培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）；HPX-9082不銹鋼電熱培養箱（上海博訊實業有限公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；MODEL800S 組織粉碎機（上海凌初環保儀器有限公司）。試驗在河南農業大學生命科學學院植物解剖與生理研究室，于2019年3—5月進行。

1.2 樣品的制取

1.2.1 玉米培育 玉米培育參考胡秀麗等[14]水培育苗方法。選取3 個玉米品種的飽滿籽粒，用2%次氯酸鈉(NaClO)進行浸泡消毒10 min，蒸餾水沖洗3～5次后保持33℃恒溫水浴避光浸種8 h。將浸種后的籽粒轉入28℃黑暗培養箱中催芽1～3天，選取萌發狀態一致的籽粒移入水培周轉箱，置于光照培養箱培養，溫度控制在28℃/22℃（晝/夜），光合有效輻射(PAR)為400 μmol/(m2·s)，相對濕度(75±5)%，光周期14 h/10h（晝/夜）。

1.2.2 制備樣品材料 待玉米幼苗的第3片葉完全展開后對植株進行分組處理，一組玉米幼苗正常培育作為對照組(CK)，另一組置于將營養液換為18%PEG6000的周轉箱作為脅迫組(Drought)，處理時間為4 h。處理完成后，分別剪取2 組玉米幼苗第一片葉葉基以上部位為試驗材料，于60℃恒溫電熱箱2 h烘干，經組織粉碎機粉碎過40 目分樣篩，收集粉末于采樣自封袋中，做好標記放置在干燥器中備用。

1.2.3 樣品提取液的制備 根據黃酮類化合物易溶于乙醇與熱水的提取特性，采用60%乙醇水浴加熱的方法制備提取液[15]。準確稱取1.2.2 中制備的玉米樣品0.05 g 于10 mL 離心管，加入60%乙醇，將離心管做好標記于70℃恒溫水浴中加熱4 h，充分提取樣品中的黃酮類化合物，離心后取上清液于10 mL容量瓶，用60%乙醇定容備用。

1.2.4 亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法反應體系的設計 吸取1.2.3中制備的樣品提取液2 mL于10 mL容量瓶，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻后放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液5 mL，并用60%乙醇溶液定容，混勻后放置15 min即得樣品反應混合液。

1.3 總黃酮含量的測定

1.3.1 蘆丁標準曲線的建立 稱取適量蘆丁標準品，使用60%乙醇溶解定容，制得蘆丁標準溶液(0.2 mg/mL)。分別吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的蘆丁標準溶液(0.2 mg/mL)于10 mL容量瓶，按照1.2.4方法制得蘆丁標準品反應混合液，利用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描，選取峰值位置（本試驗吸收峰位置為508 nm處）。以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標，508 nm處的吸光值(a.u.)為縱坐標，繪制標準曲線，求出線性回歸方程y=ax+b。

1.3.2 方法學考察

（1）線性考察。按照1.2.3 方法制備樣品提取液，將其分別稀釋為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL 的樣品提取液，與亞硝酸鈉-硝酸鋁體系反應后測定紫外-可見吸收光譜圖，確定各濃度樣品反應混合液508 nm處吸光值，并以樣品濃度(mg/mL)為橫坐標，508 nm處的吸光值(a.u.)為縱坐標，繪制標準曲線，求出線性回歸方程。

（2）精密度試驗。準確稱量相同樣品6 份，按照1.2.3方法平行制備樣品提取液，用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮含量。

（3）穩定性試驗。將已按照1.2.3方法制備的樣品提取液放置于4℃冰箱，每隔0.5 h測定其總黃酮含量。

（4）加標回收率考察。稱取6 份樣品，分別加入0.5 mL濃度為0.02 mg/mL的蘆丁標準品溶液，與亞硝酸鈉-硝酸鋁體系反應后測定508 nm 處吸光值，計算其總黃酮含量與加標回收率。回收率的計算見公式(1)。

式中，P表示加標回收率，C1表示樣品測定值，C2表示加標樣品測定值，C3為加標量。

1.3.3 單位樣品的總黃酮含量測定 根據1.2.3 方法制備干旱脅迫前后3 個品種玉米幼苗葉片的提取液，按照1.2.4 方法制得各樣品反應混合液，測定508 nm 處吸光值，根據1.3.1蘆丁標準品溶液濃度與吸收峰值的線性回歸方程，求各樣品蘆丁當量濃度，計算見公式(2)。

其中，C為單位樣品總黃酮含量，A508為樣品反應混合液508 nm處吸光值，a、b為1.3.1蘆丁線性回歸方程y=ax+b中相同常量。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的建立

使用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定樣品總黃酮含量，通常采用蘆丁為標準品[16]。根據1.3.1所得光譜圖（如圖1所示），蘆丁標準品反應混合液在508 nm處有明顯的吸收峰，且隨著蘆丁標準品溶液濃度的升高，吸收峰值也隨之升高。表明蘆丁標準品溶液濃度在0.00～0.06 mg/mL范圍內，與吸收峰值有良好的線性關系，標準曲線如圖2 所示，其回歸方程為y=12.296x+0.049，R2=0.999。

2.2 亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定玉米幼苗總黃酮含量的方法學考察

2.2.1 線性試驗 線性試驗紫外-可見光譜圖如圖3 所示，不同濃度樣品提取液的亞硝酸鈉-硝酸鋁反應體系，在波長508 nm 處左右有最大吸收峰，與蘆丁標準溶液在亞硝酸鈉-硝酸鋁反應體系下的吸收峰一致，且隨著樣品提取液濃度的升高，吸收峰值增大，確定了亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定玉米幼苗葉片總黃酮含量的可行性。標準曲線如圖4 所示，回歸方程為y=0.152+0.113x，R2=0.983，說明不同濃度樣品提取液在1.00～6.00 mg/mL線性范圍內與亞硝酸鈉-硝酸鋁反應體系下測得的總黃酮含量有良好的線性關系。

2.2.2 精密度試驗 精密度結果如表1所示，6次平行試驗總黃酮測定結果RSD值為3.48%。證明方法精密度良好，符合試驗要求。

2.2.3 穩定性試驗 黃酮類化合物穩定性易受溫度、pH值和光照等的影響[17]，為了確定玉米幼苗葉片的黃酮類化合物提取液在實驗室環境中的穩定性，對其進行穩定性考察。測量結果如表2，穩定性試驗RSD=3.51%。表明樣品提取液在放置3.5 h內測量其總黃酮含量，數據仍具有一定的穩定性。

2.2.4 加標回收率試驗 加標回收率結果如表3顯示：6次測定的平均回收率為102.29%，RSD=0.691%。說明此測定方法準確度較高，具有可行性。

2.3 3個玉米品種干旱脅迫前后的總黃酮含量的測定

對干旱脅迫前后的3個玉米品種樣品采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法進行多次測定，根據1.3.3 中公式計算單位樣品的總黃酮含量以及各個品種干旱脅迫前后總黃酮含量的變化值，如表4所示。

3 個玉米品種葉片的測定結果顯示，干旱脅迫前總黃酮含量從高到低依次為：‘浚單20’＞‘鄭單958’＞‘豫玉22’，干旱脅迫后總黃酮含量從高到低依次為：‘鄭單958’＞‘浚單20’＞‘豫玉22’。3個品種玉米幼苗在干旱脅迫后葉片總黃酮含量均有所提升，其中‘鄭單958’提升較高，為16.21%，‘浚單20’其次，為7.61%，‘豫玉22’提升最少，為2.67%，干旱脅迫后玉米幼苗葉片總黃酮含量增加值從高到低依次為：‘鄭單958’＞‘浚單20’＞‘豫玉22’。

3 討論與結論

本研究結果顯示，一定的干旱脅迫促進玉米幼苗體內總黃酮含量的增加，這與陳貝貝等[12]銀杏葉類黃酮含量隨土壤含水量的減少而逐漸增加的研究結果以及孫愛清等[13]發現9個類黃酮代謝相關基因在干旱脅迫下顯著上調表達的研究結果一致，說明植物體內黃酮類化合物的形成積累受干旱脅迫的影響。

表1 精密度試驗結果

表2 穩定性試驗結果

表3 加標回收率試驗結果

表4 單位樣品總黃酮含量(n=5)

不同品種玉米幼苗總黃酮含量在干旱脅迫后均呈上升趨勢，但各品種的含量變化存在一定差異，‘鄭單958’與‘浚單20’玉米幼苗葉片中的總黃酮含量在干旱脅迫后提升幅度較大，‘豫玉22’提升幅度較小。王向陽等[19]關于河南省夏玉米主栽品種抗旱特性研究結果表明，‘浚單20’和‘鄭單958’均具有很強的抗旱性，趙霞等[20]關于16 種玉米的抗旱性評價研究結果也表明‘浚單20’和‘鄭單958’均具有較強的抗旱性。上述研究說明，在一定的干旱脅迫條件下，玉米幼苗葉片總黃酮含量的變化與其耐旱性相關。

使用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法檢測樣品總黃酮含量時，由于紫外-可見分光光度計檢測結果易受雜質影響，樣品總黃酮含量的提取方法顯得極為重要。白生文等[21]在沙棘果渣黃酮提取工藝結果中表示乙醇體積分數為60%時，提取率達到最大；段宙位等[22]表示乙醇體積分數達到60%時，有機溶劑與沉香葉黃酮類化合物間的極性差異才能達到最適水平，可使黃酮類化合物的溶出率達到最高。因此，本研究采用60%乙醇作為提取劑以提高黃酮類化合物的提取效率。周亞萍等[10]在檢測干旱脅迫條件下玉米幼苗4種酚酸的含量變化時發現各酚酸含量變化不同，而不同的黃酮類化合物之間存在相互作用，表現出協同、拮抗、加成的抗氧化效應[23]。因此，若要進一步研究玉米幼苗黃酮類化合物與環境間的相關性，還需要用其他能夠精準定性定量的方法如高效液相質譜串聯等進一步研究玉米幼苗體內單一黃酮類物質對干旱脅迫的響應。

本研究采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法來測定不同品種玉米幼苗在PEG6000 模擬干旱脅迫前后的總黃酮含量變化。試驗選取‘鄭單958’、‘浚單20’與‘豫玉22’3個不同耐旱性的玉米品種作為研究對象，并對檢測方法亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法進行方法學考察，結果顯示，精密度RSD值為3.48%、穩定性RSD值為3.51%、平均回收率達到了102.29%，均符合方法學要求。亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定結果顯示，‘鄭單958’、‘浚單20’和‘豫玉22’玉米幼苗在模擬干旱脅迫后葉片總黃酮含量分別提升了16.21%、7.61%、2.67%。表明耐旱性強的玉米品種‘鄭單958’與‘浚單20’幼苗葉片的總黃酮含量較耐旱性差的‘豫玉22’提升幅度更大。上述研究結果證實，玉米幼苗葉片中總黃酮含量受干旱脅迫的影響，且在一定的干旱脅迫條件下，不同品種玉米幼苗葉片總黃酮含量的變化與其耐旱性相關。