接種外源微生物對堆肥中重金屬銅鋅鉛形態變化的影響

郝麗娜 常瑞雪 李彥明 汪 杰 陳 清 趙恒宇

(中國農業大學 資源與環境學院/農田土壤污染防控與修復北京市重點實驗室，北京 100193)

堆肥化處理是有機固體廢物在多種微生物作用下將原料中不穩定有機類物質轉化為穩定腐殖質類物質的過程，也是當前我國養殖糞污綜合利用所采用的主要技術途徑[1-2]，其中殘留的重金屬已成為限制畜禽糞便肥料化循環安全利用的主要因素[3]。殘留重金屬有機固體廢棄物經堆肥后，由于有機物質大量降解而導致重金屬相對濃縮[4-5]，但作物對堆肥產品中重金屬的吸收比例顯著降低[6-7]。為強化堆肥過程對重金屬的鈍化作用，利用外源物質降低堆肥重金屬有效性是當前的研究熱點,如生物炭和粉煤灰等[8-9]。

堆肥接種劑和功能微生物肥料是我國當前發展迅速的一個領域。在堆肥過程中添加微生物菌劑多集中在促進有機物快速降解、加快堆肥進程和抗病方面，其中涉及到微生物種類主要由木霉屬、芽孢桿菌屬和酵母屬[10]。木霉屬微生物通常被用作拮抗病原菌的功能菌，比如接種木霉可以有效延長牛糞堆肥的高溫期和減少氮素損失，還可拮抗辣椒疫霉[11-12]。用于堆肥的芽孢桿菌屬微生物多屬于嗜熱菌，是高溫好氧堆肥中的優勢菌，比如解淀粉芽孢桿菌可高效分解堆肥原料中的難降解的乙基纖維素，促進堆肥升溫，其堆肥產品還可防控草莓土傳病害[13-14]。酵母菌通常由于其發酵作用被添加在EM菌劑、VT菌劑等接種劑中，酵母菌群在堆肥中可以促進堆肥發酵，還可以合成生物活性物質，從而為其他的菌群提供養分[15]。在污水體系中，Siddiquee等[16]研究發現木霉對Cu和Pb具有很好的耐受性，并且具有很好的吸收能力，Allievi等[17]研究發現芽孢桿菌的表層蛋白可以對Zn產生吸附作用，Machado等[18]研究發現釀酒酵母活細胞和死細胞的形態及表面官能團沒有明顯變化，死細胞仍然對Cu有很好的吸附效果。但是目前在堆肥體系中微生物對重金屬作用的研究鮮見報道，此方向具有很好的研究價值。本研究依據前人的研究，采用室內模擬堆肥試驗的方法，探究接種外源微生物長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)對堆肥重金屬銅鋅鉛形態的影響，旨在為優化堆肥工藝和畜禽糞便安全利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

堆肥試驗所用的豬糞取自北京市昌平區某規模化養豬場，玉米秸稈取自中國農業大學上莊試驗站，經自然風干后粉碎至1 cm以下備用，供試豬糞與玉米秸稈的理化性狀如表1所示；所用的微生物菌劑長枝木霉和解淀粉芽孢桿菌由山東金正大生態工程股份有限公司提供，釀酒酵母為市售食品級粉狀菌劑(由安琪酵母股份有限公司生產)。

表1 供試豬糞與玉米秸稈的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of swine manure and maize straw

1.2 試驗操作與樣品采集

按照混合物料初始含水率60%左右和碳氮比25左右的要求，將6 kg豬糞和2 kg玉米秸稈和2.4 L水混合均勻后平均分4份，設置不接種外源微生物的對照處理(CK)和按照濕重比5‰分別接種長枝木霉(T1)、解淀粉芽孢桿菌(T2)和釀酒酵母(T3)處理，同時采集混合物料的樣品以備后續測定。將所有處理充分混合均勻等重加入8 L堆肥發酵罐，連接好堆肥反應器系統的傳感器和管路，堆肥發酵罐底部和頂部分別置有進氣口和出氣口，均與硅膠管相連。進氣口與氣泵相連，對混合物料進行曝氣，以保證整個過程處于好氧反應，每個發酵罐曝氣量由轉子流量計控制，調節曝氣量為200 mL/min。進氣口連接NaOH和硼酸溶液的吸收瓶，出氣口分別連接2%硼酸溶液和1 moL/L NaOH吸收瓶。整個堆肥反應器系統的構成如圖1所示。

之后分別在第3、7、12、19和26 d進行翻堆取樣，樣品采集采用多點采樣法收集樣品，然后用四分法取樣，每次采集2份樣品，一份立即進行冷凍處理(<-18 ℃)，用于測定pH、發芽指數(GI值)等指標；另一份經自然風干后，粉碎至100目備用，用于測定物料全碳、重金屬總量和形態等指標。

圖1 堆肥裝置示意圖
Fig.1 Schematic diagram of compost plant

1.3 分析方法

溫度傳感器為Pt-100，采集頻率為每1 h記錄1次數據；CO2累積量采用氫氧化鈉吸收法，吸收液由0.1 moL/L的稀硫酸溶液滴定；物料有機質含量采用灼燒法測定[19]；GI值測定如下：稱取10 g鮮樣于250 mL塑料瓶中，按照固液比為1∶10，加 100 mL 去離子水，在恒溫搖床上(25 ℃和200 r/min)震蕩30 min，過濾得到浸提液，然后吸取5 mL于墊有定量濾紙的直徑為9 cm的培養皿中，均勻的撒10個水蘿卜種子，在避光和25 ℃的條件下培養 48 h 后測定，以加去離子水的培養為對照。GI(%)參照如下計算公式計算：

重金屬總量采用王水提取法提取消解，重金屬形態采用改進的BCR連續提取法[20]，主要包含可交換態、可還原態、可氧化態和殘渣態。重金屬含量使用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)測定。重金屬相關計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 不同處理對堆肥理化性質的影響

在堆肥過程中，微生物降解有機物會伴隨熱量產生，因此堆體溫度的高低與微生物的新陳代謝作用密切相關[10]。由圖2(a)可知，4個處理溫度達到60 ℃以上的時間分別是第4、1、1和3天，即接種外源微生物有效縮短了堆體進入高溫期的時間，且接種長枝木霉或解淀粉芽孢桿菌縮短了3 d，接種釀酒酵母可縮短1 d。《GB 7959—2012糞便無害化衛生標準》[21]中規定畜禽糞便堆肥溫度在50～55 ℃以上持續5～7 d即可達到無害化，本試驗4個堆肥處理 55 ℃ 以上高溫期分別為12、13、13和18 d，均已達到無害化標準，且在堆肥中接種微生物延長了高溫期。在微生物降解堆肥有機質的過程中會利用環境中的O2，釋放CO2和水。由圖2(b)可知，堆肥第2～13天為CO2釋放的高峰期，這也與堆肥溫度變化趨勢大致相同。由圖2(c)可知，各堆肥處理的有機質含量均隨堆肥時間推移逐漸減少，CK、T1、T2和T3處理的有機質含量較各自初始值分別減少了11.16%、15.38%、18.23%和15.15%，即T2中添加解淀粉芽孢桿菌后更利于有機質的降解。由圖2(d)可知，接種微生物的處理GI值均在堆肥 12 d 率先超過80%，CK處理在第26天超過80%，表明接種長枝木霉和解淀粉芽孢桿菌比對照提前14 d實現堆肥腐熟。在堆肥26 d結束時，各處理的GI值為92.11%～107.63%，排序為T3>T2≈T1≈CK，表明堆肥腐熟度極高。

2.2 銅(Cu)的形態變化

由圖3(a)可知，各處理的可還原態Cu分配率由堆肥前的38.19%分別降至11.86%、10.00%、4.98%和11.04%；相對應的Cu可氧化態分配率由堆肥前的30.79%增為65.39%、59.05%、75.73%和60.17%，這表明堆肥后Cu向更穩定的形態發生轉變。將Cu可交換態和可還原態分配率加和為有效態來看，由圖3(b)可知，有效態相對鈍化率為T2(80.96%)>T1(67.46%)>T3(64.08%)>CK (63.61%)，這表明與對照相比，接種微生物可以使得Cu的有效性進一步降低，且解淀粉芽孢桿菌鈍化效果>長枝木霉>釀酒酵母。

2.3 鋅(Zn)的形態變化

由圖4(a)可知，Zn在堆肥前后均以可交換態和可還原態為主，二者之和占比達75.87%～81.51%，而可氧化態和殘渣態占比較低，表明堆肥中Zn的有效性較高。經過堆肥后各處理Zn可交換態分配率變化較為明顯，從堆肥前的25.30%分別降至11.27%、10.81%、9.26%和9.54%，從Zn的可交換態相對鈍化率來看，T2(63.38%)>T3(62.28%)>T1(57.27%)>CK(55.45%)。由圖4(b)可知，將Zn可交換態和可還原態分配率之和作為有效態來比較相對鈍化率，T2(5.02%)>T3(0.10%)>T1(-0.30%)>CK(-2.05%)，這表明較對照而言，在堆肥中接種解淀粉芽孢桿菌和釀酒酵母可以進一步降低Zn的有效性。

圖2 溫度(a)、CO2累積排放量(b)、有機質含量(c)、GI(d)變化
Fig.2 Changes of composting temperature (a), cumulative CO2emissions (b), Organic matter (c) and GI (d)

圖3 堆肥前后Cu各形態變化(a)及相對鈍化率(b)
Fig.3 Cu morphology changes before and after compost (a), relative passivation rate of Cu after compost(b)

2.4 鉛(Pb)的形態變化

由圖5(a)可知，與對照相比，接種長枝木霉后可氧化態分配率提高了30.49%，接種解淀粉芽孢桿菌堆肥后可還原態Pb分配率降低了40.89%，接種釀酒酵母后Pb殘渣態分配率提高了56.00%。由圖5(b)可知將Pb可交換態和可還原態分配率之和作為有效態來比較Pb的相對鈍化率，可以得出：T2(41.00%)>T3(11.51%)>T1(5.01%)>CK(2.54%)，這表明與對照相比，接種微生物可以進一步降低Pb的有效性，并且接種解淀粉芽孢桿菌的效果最佳。

3 討 論

重金屬的可交換態、可還原態、可氧化態和殘渣態這四種形態的有效性依次降低，因此本研究主要通過對比堆肥前后可交換態和可還原態分配率變化來判斷重金屬鈍化效果[22]。由圖2溫度、CO2累積排放量、有機質含量和GI值數據可知，在豬糞和玉米秸稈的堆肥中分別接種長枝木霉、解淀粉芽孢桿菌、釀酒酵母后加速了堆體升溫、促進了有機質的降解并且加快了堆肥腐熟，這是因為接種外源微生物后提高了堆肥體系中微生物的活性，優化了微生物的種群結構[23]，且綜合作用效果解淀粉芽孢桿菌>長枝木霉>釀酒酵母，這也與重金屬銅鋅的鈍化效果一致，加入解淀粉芽孢桿菌的處理對銅鋅鉛的形態變化均表現出明顯效果，加入長枝木霉和釀酒酵母對銅鋅鉛的作用效果雖不及解淀粉芽孢桿菌，但也優于對照組。因此，堆肥體系中微生物的活性高低可能會與重金屬的鈍化有很大關聯。

圖4 堆肥前后Zn各形態變化(a)及相對鈍化率(b)
Fig.4 Zn morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Zn after compost (b)

圖5 堆肥前后Pb各形態變化(a)及相對鈍化率(b)
Fig.5 Pb morphology changes before and after compost (a) and relative passivation rate of Pb after compost (b)

這是由于微生物細胞壁表面的脂多糖、肽聚糖、膜蛋白、脂磷壁酸和磷壁酸等結構使得其具有了羧基、羥基、氨基、磷基和硫基等官能團[24-25]。微生物細胞表面的羧基和羥基等活性官能團上的N、O和S等原子利用孤對電子與Cu2+、Zn2+和Pb2+發生配位發生絡合和鰲合反應[26-28]，另外細胞壁表面的硫基和磷酸基可以和重金屬離子結合形成沉淀[29]，并且這種微生物產生的化學作用不會隨著微生物的凋亡而結束，細胞凋亡后微生物細胞壁表面的官能團也不會被破壞。Carrie等[30]指出木霉可以利用氨基、硫基、羰基與Cu和Pb發生絡合、鰲合反應，Allievi等[17]研究發現芽孢桿菌表層蛋白對Zn2+有很好的吸附作用，Machado等[18]指出釀酒酵母對Cu有很好的絡合作用。這均與本研究結果一致，長枝木霉對Cu和Pb有較好的鈍化作用，解淀粉芽孢桿菌對Zn表現出很好的鈍化作用，釀酒酵母對Cu的鈍化效果較好。另外，微生物生命活動過程中會分泌胞外聚合物，這些物質也是大分子的蛋白質多糖化合物，可以和重金屬離子發生絡合、鰲合反應[31]。也有研究指出生防芽孢桿菌可以分泌鐵鰲合酶，而這種鐵鰲合酶也可以結合Zn2+[32]，這也可能是本研究中解淀粉芽孢桿菌對Zn有較好鈍化效果的原因。

但是由于微生物的生命活動和細胞的降解，微生物對重金屬產生的作用僅是相對的鈍化，并非絕對鈍化，待有機肥施用到土壤中，經歷漫長歲月后重金屬是否依然被固定，這值得進一步研究。

4 結 論

1)在豬糞和玉米秸稈堆肥體系中在接種外源微生物對堆肥理化性質有了明顯改善。首先接種外源微生物可提前3、3、1 d使堆肥溫度上升至60 ℃并延長高溫期；其次接種微生物后堆肥體系中有機質的降解量明顯加大；另外接種長枝木霉和解淀粉芽孢桿菌還明顯縮短了腐熟過程。

2)添加外源微生物后明顯降低了重金屬Cu、Zn和Pb的有效性。3種微生物中，解淀粉芽孢桿菌對Cu、Zn和Pb的有效性降低效果都較好。相對鈍化率分別為80.96%、5.02%和41.00%；長枝木霉對Cu和Pd的有效性降低效果較好，相對鈍化率分別為67.09%和5.01%；釀酒酵母對Cu和Pb的有效性降低效果較好，相對鈍化率分別為64.46%和11.51%。因此可以針對不同需求選擇微生物。