粗毛纖孔菌總三萜的純化及對膽酸鹽結合能力分析

劉爽爽 劉東超 孫凡越 李德海* 王占斌

(1.東北林業大學 林學院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，哈爾濱 150040)

膽酸鹽是膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結構的大分子，對膽固醇和脂肪的消化吸收起重要作用。因此將膽酸鹽排出體外可降低膽酸鹽在肝腸循環過程中的積累，促進膽固醇的代謝，達到降血脂的目的[1]。辛伐他汀可以通過吸收膽酸鹽來降低高血脂癥，但長時間服用會有損害肝腎、血糖升高等副作用[2]。因此，開發有效降低血脂的天然功能性成分藥物成為熱點。已有研究表明三萜類化合物是一類有較好降血脂作用的天然產物，具有開發和應用前景[3]。

粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)屬于擔子菌亞門，主要分布在東北和新疆地區，是一種具有降血脂、抗氧化等生物活性的藥用真菌[4]，常被用于降三高以及治療消化不良、癌癥等疾病[5]。三萜類化合物是粗毛纖孔菌產生的主要生物活性成分之一，藥理試驗證明，其具有抗癌、抗病毒、降血脂等多種功能[6]。三萜類化合物提取過程中含有糖，脂類等雜質，影響了其純度和生物活性[7]。為了提高三萜類化合物的純度，不少學者致力于三萜類化合物的純化。王亞紅等[8]采用大孔樹脂來提高瓦松總三萜的純度，總三萜含量可以達到40.56%。蘇永昌等[9]采用分段沉淀法來提高海參三萜皂苷的純度。大孔樹脂雖然具有吸附性強，解吸條件溫和等優點，但其分離純度差，不利于總三萜純度的提高[10]。分段沉淀法雖然操作簡便，但難將皂苷分離完全[11]。萃取可以利用有機溶劑與三萜的相似相溶原理，將極性相似的總三萜溶解在有機溶劑中，從而提高總三萜的純度。硅膠可以利用其表面硅醇基較強的吸附作用來提高總三萜的純度[12]。為了獲得高純度的粗毛纖孔菌總三萜，本試驗擬以粗毛纖孔菌子實體及菌絲體為原材料，采用有機溶劑萃取與硅膠純化聯用的方法，分析有機溶劑種類、高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質量比、洗脫體系、洗脫劑比例對粗毛纖孔菌總三萜純度的影響。同時利用紅外光譜分析經萃取和硅膠純化后的粗毛纖孔菌菌絲體和子實體總三萜結構，進一步通過體外模擬體內環境試驗研究了粗提物和純化物總三萜的體外膽酸鹽結合能力，為選擇粗毛纖孔菌三萜類化合物高效純化方法和降血脂藥物研發提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年9月在東北林業大學林場的水曲柳上采集粗毛纖孔菌子實體，將其置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎機粉碎，過60目篩，收集篩下物，備用。

粗毛纖孔菌東北林業大學森林保護實驗室培養，獲得菌絲體，將其置于42 ℃烘箱中烘干，用小型粉碎機粉碎，過60目篩，收集篩下物，備用。

1.2 試劑及設備

氯仿、甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司)；香草醛(Sigma 公司)；柱層析硅膠(精制型)200～300 目(青島海洋化工)；大孔樹脂D101(東鴻化工有限公司)；膽酸鈉(北京市海淀區微生物培養基制品廠)；牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉(上海源葉生物技術有限公司)。

722 紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；RE-52 旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器公司)；KQ-500DE 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；硅膠層析柱50×Φ2.2 cm(上海精科實業有限公司)；IS10 傅立葉變換型紅外光譜儀(Thermo Fisher)。

1.3 方法

1.3.1粗毛纖孔菌總三萜的萃取

稱取600 g粗毛纖孔菌子實體和200 g菌絲體粉末，加入72%的乙醇，在超聲功率210 W輔助下萃取31 min后室溫浸提24 h，反復萃取5 次。合并5 次萃取液在45 ℃下旋蒸，然后在42 ℃烘箱中烘干備用。將樣品烘干后懸浮在H2O中，然后分別用相同體積的乙酸乙酯和正丁醇在室溫下萃取24 h。反復2 次，合并2 次萃取物，旋蒸后烘干，得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，備用。

1.3.2粗毛纖孔菌總三萜硅膠純化工藝比較

1)高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質量比的篩選：準確取4 mL子實體粗提物，按一定高徑比(25∶22、40∶22、55∶22、70∶22、85∶22)、上樣量和硅膠量質量比(1∶80、2∶80、3∶80、4∶80、5∶80)條件下，以V氯仿∶V甲醇=1∶1為洗脫劑，在流速1 mL/min下進行洗脫。每10 mL一管收集樣品，每管樣品中總三萜含量的計算公式為：

(1)

式中：Y為OD值。

2)洗脫體系和洗脫劑體積比的篩選：準確取 4 mL 菌絲體和子實體乙酸乙酯萃取物，在篩選得到的最佳高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)、上樣量和硅膠量質量比前提下按一定的洗脫體系(氯仿∶甲醇、丙酮∶石油醚、乙酸乙酯∶丙酮)和洗脫劑體積比(1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2)在流速為 1 mL/min 的條件下進行洗脫。根據上述方法進行樣品的收集，通過數據分析篩選出最佳的洗脫體系和洗脫劑比例。

3)洗脫樣品的處理和測定：參照文獻[13]利用香草醛-冰乙酸-高氯酸分光光度比色法測定總三萜的方法并稍作修改，具體方法如下：每管樣品吸取0.05 mL分別置于5 mL 容量瓶中，在100 ℃水浴蒸干后加入0.20 mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80 mL高氯酸，搖勻后放入溫度為70 ℃的水浴鍋中反應15 min后，常溫下放置3～5 min，再加入乙酸乙酯定量到5 mL搖勻，用不加樣品的溶液做空白對照，采用分光光度計測定樣品在551 nm處測定吸光度(OD值)。根據公式(1)計算各管中樣品的總三萜含量，繪制洗脫曲線。

將所有收集的樣品混合旋蒸后于42 ℃烘箱中烘干，然后稱取0.03 g溶解于10 mL無水乙醇中，從中吸取0.05 mL置于5 mL 容量瓶中，根據上述方法測定三萜含量。總三萜得率和純度的計算公式為：

(2)

式中：B1為柱層析后總三萜含量，mg；B2總三萜含量，mg。

(3)

式中：C1為柱層析后總三萜質量，mg；C2為柱層析后總樣品質量，mg。

4)不同純化方法的比較：分別用的硅膠純化法[14]和大孔樹脂吸附法[15]對粗毛纖孔菌菌絲體和子實體原料進行純化，將純化得到的樣品按照上述方法進行總三萜純度的測定。

1.3.3粗毛纖孔菌總三萜的紅外光譜分析

參照參考文獻[16]的方法，利用傅立葉變換型紅外光譜儀，以溴化鉀為背景，采用溴化鉀壓片法在500～4 000/cm-1掃描經乙酸乙酯萃取和硅膠純化后的菌絲體和子實體總三萜成分。通過數據分析粗毛纖孔菌菌絲體和子實體的官能團結構。

1.3.4粗毛纖孔菌總三萜體外膽酸鹽結合能力檢測

參照文獻劉榮等[17]利用分光光度計繪制標準曲線的方法并稍作修改, 具體方法如下：分別取2 mL不同濃度的標準溶液(甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L，牛磺膽酸鈉0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L，膽酸鈉0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L)于具塞試管中，加入6 mL 60%的H2SO4于70 ℃水浴20 min，取出冰浴5 min，采用分光光度計測定樣品在387 nm處測定吸光度，最后，以膽酸鹽濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制膽酸鹽的標準曲線。

參照參考文獻[17]體外模擬體內環境測定膽酸鹽結合能力的方法并稍作修改，具體方法如下：分別移取1 mL樣品(菌絲體粗提總三萜、子實體粗提總三萜、菌絲體純化后總三萜、子實體純化后總三萜)，加入1 mL(10 mg/mL)胃蛋白酶，3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，以 0.10 mol/L 的NaOH溶液調節pH至6.30，隨后加入4 mL(10 mg/mL)胰蛋白酶，在37 ℃恒溫振蕩消化1 h，最后加入4 mL(1 mmol/L)膽酸鹽消化1 h，400 0 r/min離心20 min，對上清液中的膽酸鹽進行分析。

1.4 統計學分析

試驗中的測試均平行檢測3次。基礎數據統計采用Excel 軟件，圖表均采用Origin 9.0處理完成，顯著性分析采用SPSS 21.0 軟件。

2 結果與分析

2.1 粗毛纖孔菌總三萜的萃取

比較不同萃取劑對總三萜含量的影響，結果發現乙酸乙酯和正丁醇萃取后菌絲體和子實體粗提總三萜的純度得到明顯提高(表1)：600 g粗毛纖孔菌子實體在72%乙醇提取下可得到總三萜純度為9.20%的粗提物86.19 g(留4 g備用)。乙酸乙酯和正丁醇萃取后總三萜純度得到顯著提高，其中乙酸乙酯萃取后純度可以達到32.70%，是子實體粗提物的3.55 倍，正丁醇萃取后純度達到了13.07%，是子實體粗提物的1.42 倍。200 g粗毛纖孔菌菌絲體在72%乙醇提取下可得到純度為15.33%的粗提物35 g(留1 g備用)。乙酸乙酯萃取后純度可達到46.70%，是菌絲體粗提物的3.04 倍，正丁醇萃取后純度可達到18.16%，是菌絲體粗提物的1.18倍。

表1 不同萃取劑對粗毛纖孔菌總三萜含量的影響Table 1 Effect of different solvents on the content of total triterpenoids from Inonotus hispidus

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。不同萃取劑萃取純度之間的差異用a、b表示。同列不同大寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。菌絲體和子實體純度之間的差異用C、D表示。

Note： Different small letters within same raw indicate significant differences (P<0.05). Purity differences among different solvents are represented by a and b. Different capital letters within same column indicate significant differences (P<0.05). Purity differences between fruiting body and mycelium are represented by C and D.

2.2 硅膠柱層析分離條件對粗毛纖孔菌總三萜純度的影響

2.2.1不同高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)對總三萜純度的影響

采用不同的硅膠高度對樣品進行洗脫，通過對收集樣品總三萜純度、得率和洗脫效果的分析，篩選出最佳的高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)，結果見圖1(a)和(b)。當高徑比<55∶22時，總三萜的純度、得率和洗脫效果隨著高徑比的增加而提高。當高徑比55∶22時，三萜類化合物的洗脫效果最好，總三萜純度和得率的最大值分別為28.18%、95.16%。當高徑比>55∶22時，總三萜的純度、得率和洗脫效果隨著高徑比的增加而降低。故高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)選擇55∶22。

2.2.2不同上樣量和硅膠量質量比對總三萜純度的影響

在不同的上樣量情況下對樣品進行洗脫，通過收集樣品進行總三萜純度、得率和洗脫效果的分析，篩選出最佳的上樣量和硅膠量質量比，具體結果見圖2(a)和(b)。在上樣量和硅膠量質量比為 4∶80 時，總三萜的洗脫效果最好，純度和得率最大，分別為28.18%、95.16%；當上樣量和硅膠量質量比< 4∶80時，總三萜的純度、得率和洗脫效果隨著上樣量和硅膠量質量比的增加而提高；當上樣量和硅膠量質量比>4∶80時，隨著比例的增大，總三萜的純度、得率和洗脫效果不僅降低，且在洗脫過程中產生了嚴重的拖尾現象。故上樣量和硅膠量質量比選擇4∶80。

2.2.3不同洗脫體系對乙酸乙酯萃取物總三萜純度的影響

采用不同的洗脫體系對粗毛纖孔菌菌絲體和子實體進行洗脫，通過對收集樣品總三萜純度、得率和洗脫效果的分析，篩選出最佳的洗脫體系，結果見圖3(a)、(b)和(c)。分析結果發現：丙酮∶石油醚體系對乙酸乙酯萃取后總三萜的洗脫效果最好，子實體和菌絲體總三萜純度最大，分別為36.01%、54.00%。由圖3(a)、3(b)可知，在洗脫體系為氯仿∶甲醇時，總三萜還沒來得及分離就已被完全洗脫；乙酸乙酯∶丙酮體系總三萜洗脫效果較差，產生拖尾。故洗脫體系選擇丙酮∶石油醚。

(a)高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)三萜純度和得率圖；(b)洗脫曲線(收集樣品30 管，后20 管的三萜含量趨近于0，故圖顯示10 管樣品) 不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。純度之間的差異用a、b、c表示。得率之間的差異用d、e、f表示。圖2同。
(a)The purity and yield of total triterpenoids under different height-to-diameter ratios (height of silica gel∶diameter of silica gel); (b) The elution curve (A total of 30 tubes of samples are collected. The content of total triterpenoids of the last 20 tubes tended to be zero. Therefore only first 10 tubes are shown in the figure) Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences among purity are represented by a, b and c. Differences among yield are represented by d, e and f. The same in
Fig.2.
圖1 不同高徑比對總三萜純度的影響
Fig.1 Effect of different height-to-diameter ratios on purity of total triterpenoids

(a)上樣量和硅膠量質量比三萜純度和得率圖；(b)洗脫曲線
(a) The purity and yield of total triterpenoids with different sample mass-to-silica gel mass. (b) The elution curve
圖2 不同上樣量和硅膠量質量比對總三萜純度的影響
Fig.2 Effect of different sample and silica gel ratios on the purity of total triterpenoids

2.2.4不同洗脫劑比例對乙酸乙酯萃取總三萜純度的影響

采用不同的洗脫劑比例對粗毛纖孔菌菌絲體和子實體進行洗脫，通過對收集樣品的總三萜純度、得率和洗脫效果分析，篩選出最佳的洗脫劑比例，具體結果見圖4(a)、(b)和(c)。當V丙酮∶V石油醚=3∶1 時，乙酸乙酯萃取總三萜的洗脫效果最好，子實體和菌絲體總三萜純度最大，分別為42.32%、65.35%。由圖4(a)和(b)洗脫曲線可知，隨著丙酮比例的增加，各管中總三萜的含量明顯的增加。當V丙酮∶V石油醚>3∶1時，各管中總三萜的含量明顯的減少。故V丙酮∶V石油醚選擇3∶1。

(a)子實體洗脫曲線；(b)菌絲體洗脫曲線；(c)洗脫體系對總三萜純度影響圖 不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。子實體總三萜純度之間的差異用a、b表示。菌絲體總三萜純度之間的差異用c、d表示。圖4同。
(a) The elution curve of fruiting body; (b) The elution curve of mycelium; (c) The effect of elution system on purity of total triterpenoids Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences of among total triterpenoids purity of fruiting body are represented by a and b. Differences among total triterpenoids purity of mycelium are represented by c and d. The same in
Fig.4.
圖3 不同洗脫體系對乙酸乙酯萃取物總三萜純度的影響
Fig.3 Effect of different elution systems on purity of total triterpenoids extracted by ethyl acetate

2.3 不同分離純化方法對總三萜純化效果的影響

比較不同純化方法對粗毛纖孔菌總三萜純度的影響，結果見表2。子實體經萃取和硅膠純化后的總三萜純度為42.32%，是大孔樹脂純化和單純硅膠純化所得總三萜純度的2.02、1.56 倍。菌絲體經萃取和硅膠純化后的總三萜純度為65.35%，是大孔樹脂純化和單純硅膠純化所得總三萜純度的2.12和1.39倍。

2.4 粗毛纖孔菌純化物總三萜紅外光譜分析

通過紅外光譜對粗毛纖孔菌子實體和菌絲體純化后的總三萜進行結構分析發現，菌絲體和子實體可能因培養環境的不同造成結構之間的差異。總三萜在3 551/cm-1和3 415/cm-1處存在O-H鍵伸縮振動峰。菌絲體純化后，總三萜在 2 926/cm-1處存在較強的吸收峰，其可歸因于對稱或者非對稱的—CH2、—CH3的伸縮振動；子實體純化后，總三萜在此處的振動峰減弱。菌絲體純化后總三萜在 1 613/cm-1處存在較強 C=C 伸縮振動峰，子實體純化后總三萜的C=C縮振動峰減弱。子實體純化后總三萜在1 548/cm-1存在較強的非對稱變型的—CH3伸縮振動峰；菌絲體純化物總三萜的非對稱變型的—CH3伸縮振動峰減弱。菌絲體純化后總三萜在1 372/cm-1處存在弱的吸收峰，歸因于對稱變形的—CH3存在；子實體純化后總三萜在此處不存在對稱變形的—CH3。

(a)子實體洗脫曲線；(b)菌絲體洗脫曲線；(c)洗脫比例對純度影響圖
(a) The elution curve of fruiting body; (b) The elution curve of mycelium; (c) The effect of eluent ratio on purity of total triterpenoids
圖4 不同洗脫劑比例對乙酸乙酯萃取總三萜純度的影響
Fig.4 Effect of different eluent ratios on purity of total triterpenoids extracted by ethyl acetate

表2 不同純化方法對總三萜純度的影響
Table 2 Effects of different purification methods on the purification of total triterpenoids %

粗毛纖孔菌Inonotus hispidus萃取后硅膠純化Purified with silicagel after extraction硅膠純化Purified withsilica gel大孔樹脂純化Purified withmacroporous resin子實體總三萜純度Purity of total triterpenoids in fruiting body42.32±1.54 aC27.06±1.63 bC20.94±1.63 bC菌絲體總三萜純度Purity of total triterpenoids in mycelium65.35±1.67 aD46.92±1.21 bD30.80±1.21 cD

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。不同純化方法純度之間的差異用a、b、c表示。同列不同大寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。菌絲體和子實體純度之間的差異用C、D表示。

Note： Different small letters within same raw indicate significant differences (P<0.05). Purity differences among different purification methods are represented by a, b and c. Different capital letters within same column indicate significant differences (P<0.05). Purity differences between fruiting body and mycelium are represented by C and D.

子實體純化后總三萜在1 294/cm-1處存在—S-O反對稱伸縮振動峰；菌絲體純化后總三萜在此處不存在—S-O反對稱伸縮振動峰。子實體純化后總三萜在812/cm-1處存在=C-H振動峰；菌絲體純化后總三萜在此處不存在=C-H振動峰。子實體純化后總三萜在962/cm-1處存在C-O和C-C振動峰；菌絲體純化后總三萜在此處不存在 C-O和C-C振動峰。說明菌絲體和子實體總三萜官能團存在差異，但都符合三萜類物質的特征結構。

2.5 粗毛纖孔菌總三萜對體外膽酸鹽結合能力的影響

比較粗提和純化后粗毛纖孔菌總三萜對體外膽酸鹽結合能力的影響，結果見圖5。粗毛纖孔菌菌絲體和子實體粗提物的總三萜經純化后，膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉的結合能力增強。其中菌絲體總三萜經純化后，對三種膽酸鹽的結合能力最強分別為1.14、1.78和2.06 μmol/100 mg，是菌絲體粗提物總三萜膽酸鹽結合能力的1.56、1.73和1.72 倍。

不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。膽酸鈉之間的差異用a、b、c表示。甘氨膽酸鈉之間的差異用d、e、f 表示。牛磺膽酸鈉之間的差異用j、h、k表示。 Different small letters indicate significant differences (P<0.05). Differences among sodium cholate treatments are represented by a, b and c. Differences among sodium glycocholate treatments are represented by d, e and f. Differences among sodium taurocholate treatments are represented by j, h and k.
圖5 總三萜體外膽酸鹽結合量
Fig.5Invitrobile salt binding amount of total triterpenoids

3 討論與結論

三萜類化合物具有抗癌、抗病毒、降血脂等多種功能[6]。為了提高三萜類化合物的純度和生物活性，已有研究采用成本低廉的大孔樹脂用于三萜類化合物純化，例如：徐紅云[18]采用大孔樹脂純化粗毛纖孔菌三萜，純度可以達到27.82%；金文芳等[15]純化馬蘭總三萜，純度可以達到17.81%。大孔樹脂雖然具有吸附性強、解吸條件溫和等優點，但其分離純度差，不利于總三萜純度的提高[10]。本試驗基于有機溶劑萃取法，具有操作簡便、可以避免活性成分損失的優點，而且硅膠干擾因素少、選擇性高、可循環利用和表面硅醇基較強吸附作用[12,19-20]。研究了有機溶劑萃取與硅膠聯用對粗毛纖孔菌總三萜純度的影響。本研究發現高徑比(硅膠高∶硅膠柱直徑)55∶22、上樣量和硅膠量質量比4∶80、洗脫體系為丙酮∶石油醚、洗脫劑體積比為3∶1時，菌絲體和子實體經乙酸乙酯萃取后的總三萜純度顯著提高，分別為65.35%、42.32%。其中，子實體乙酸乙酯萃取及硅膠純化后的總三萜純度是之前文獻通過大孔樹脂純化粗毛纖孔菌三萜的1.52 倍[18]。本試驗方法用于粗毛纖孔菌三萜的純化，不僅操作簡單方便，還可以大幅度提高三萜的純度和生物活性，可以為粗毛纖孔菌三萜類化合物高效純化方法的選擇提供試驗基礎。有研究表明三萜類化合物可以促使膽固醇在肝臟中更快地轉化膽汁酸，能較好地與膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結合。其中牛磺膽酸鈉的結合量最大，可能是在羥基含量相同時，牛磺膽酸鈉的疏水性比膽酸鈉和甘氨膽酸鈉更強，可以通過疏水作用能更好地吸附于其他羥基中，從而達到較好的降血脂效果[16, 21]。

本研究發現：菌絲體總三萜純化后的膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉結合能力都得到了增強，分別為1.14、1.78和2.06 μmol/100 mg；子實體純化后總三萜的膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉結合能力分別為0.89、1.49和1.77 μmol/ 100 mg；子實體總三萜經萃取和硅膠純化后的膽酸鈉、甘氨膽酸鈉和牛磺膽酸鈉分別是前期課題組[22]大孔樹脂純化后總三萜的1.39、1.18和1.12 倍。上述結果表明說明本試驗通過有機溶劑的初步萃取和硅膠條件的優化，顯著提高了粗毛纖孔菌總三萜純度和體外膽酸鹽的結合能力，然而粗毛纖孔菌菌絲體和子實體總三萜單體的分離和結構仍需深入鑒定。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，對人體有保健作用，對疾病有治療、預防或抑制作用。因此，進一步研發粗毛纖孔菌的功能成分尤其是三萜類化合物的功，對藥用真菌的研究和利用具有重要意義。