蘆薈鮮藥汁保鮮工藝技術(shù)及效期研究*

徐俊鴻 鄧卓燕 譚志濱 歐陽燕婷

蘆薈是多年生百合科草本植物，富含多種活性物質(zhì)，素有“萬應(yīng)良藥”“天然美容師”“家庭醫(yī)生”等美稱[1-4]。2015年版《中華人民共和國藥典》收載的蘆薈，為蘆薈汁的濃縮干燥物，功能清肝熱、通便，用于便秘、小兒疳積、驚風(fēng)，外治濕癬?，F(xiàn)代藥理研究表明，蘆薈可以調(diào)節(jié)機體免疫[5]、抗病毒、抗菌消炎[6]、促進傷口愈合、減少瘢痕形成等，外用對化療性靜脈炎、動靜脈內(nèi)瘺功能維護、褥瘡及痤瘡等有良好的療效[7-12]?，F(xiàn)生產(chǎn)的蘆薈鮮藥汁臨床主要用于預(yù)防和治療放化療后皮炎和靜脈炎，但因其為現(xiàn)榨現(xiàn)用難以保存。本研究以蘆薈鮮藥汁為對象，用不同的物理和化學(xué)保鮮方法進行處理，探索出最優(yōu)的保鮮技術(shù)并確定保質(zhì)期，解決蘆薈鮮藥汁生產(chǎn)上的不便，為產(chǎn)品的批量生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司，UV-3000)；萬分之一天平(常州幸運電子設(shè)備有限公司，F(xiàn)A2004)；黏度計(上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司，NDJ-5S)；攪拌機。甘露糖(上海源聚生物科技有限公司，批號180916)，檸檬酸(廣州化學(xué)試劑廠，AR)，抗壞血酸片(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，5180304)，亞硫酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，AR)，其它試劑均為分析純。庫拉索蘆薈，采自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬順德醫(yī)院鮮藥種植基地。

1.2 方法

1.2.1 甘露糖標準溶液的制備精密稱取甘露糖0.1 g至100 ml容量瓶，純化水溶解并定容至刻度，搖勻得1.000 mg/ml甘露糖標準儲備液。

1.2.2 苯酚-硫酸法顯色檢測精確吸取甘露糖標準儲備液0.50、1.00、2.00、2.50、5.00 ml，分別置于50 ml容量瓶，加水至刻度，分別取上述溶液及供試品溶液2.00 ml，置10 ml具塞試管中，加5%苯酚溶液1.00 ml，快速加入5.00 ml濃硫酸，靜置20 min[13]，以試劑空白為參比，在波長490 nm下測定吸光度A。

1.2.3 蘆薈鮮藥汁保鮮處理取已成熟新鮮蘆薈葉片，洗凈，去刺，削皮，刮下葉內(nèi)膠體部分打漿混勻，分裝于30 ml塑料瓶，封口備用。①物理保鮮：分別將蘆薈鮮藥汁放置常溫、(4±2) ℃(冷藏組)以及(-18±2) ℃(速凍組)貯存，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量變化。通過對照組與物理保鮮組蘆薈多糖含量進行分析，確定最優(yōu)的保鮮溫度。②化學(xué)保鮮：分別加入不同濃度檸檬酸(0.5%、1.0%、1.5%)、不同濃度抗壞血酸(0.5%、1.0%、1.5%)，不同濃度亞硫酸鈉(0.5%、1.0%、1.5%)，置(4±2) ℃環(huán)境下保存，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量變化。通過對照組與化學(xué)保鮮組的蘆薈多糖含量進行統(tǒng)計學(xué)分析，確定最優(yōu)的防腐劑和保鮮濃度。

1.2.4 樣品蘆薈多糖的提取和測定精密稱取各組經(jīng)處理的蘆薈鮮藥汁10 g，加入4倍體積無水乙醇靜置過夜，過濾棄去上清，濾渣加水100 ml，室溫攪拌提取30 min，過濾得濾渣，濾渣用水洗，合并濾液，定容至250 ml容量瓶，即得蘆薈多糖供試品溶液，每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graph Prism 7.0對不同時間點和組別的蘆薈鮮藥汁的多糖含量進行Pearson相關(guān)分析、t檢驗以及方差分析，確定最優(yōu)的物理和化學(xué)保鮮方法。

1.2.6 長期穩(wěn)定性試驗根據(jù)1.2.4項提取方法和1.2.5項下保鮮條件平行制備3批蘆薈鮮藥汁，冷藏(4 ℃)并添加0.1%檸檬酸進行防腐，保存1個月，期間每隔2 d檢測并記錄其外觀和蘆薈多糖的含量，按照蘆薈多糖含量衰減10%的時間(T90%)確定鮮藥汁的有效期。

2 結(jié)果

2.1 鮮藥外觀性狀變化各組成品均呈黃綠色黏稠液體，具特殊臭味。其中常溫組的蘆薈鮮藥汁在成品后3 d稠度開始變稀，出現(xiàn)腐敗氣味，成品后5 d出現(xiàn)紅褐色沉淀，30 d藥汁呈紅褐色，具酸敗氣味。冷藏組和冷凍組在成品后25 d稠度開始變稀，出現(xiàn)腐敗氣味，30 d藥汁呈紅褐色，可見紅褐色沉淀。其余組別未見顏色、氣味等性狀變化。

2.2 吸收曲線分別取甘露糖標準溶液和蘆薈多糖供試品溶液2.0 ml，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，在350～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明，甘露糖和蘆薈多糖溶液在415 nm和490 nm波長下各有一吸收峰，兩者吸收曲線形狀相似。見圖1。

2.3 甘露糖標準曲線按1.2.2項下測定甘露糖標準溶液的吸光度A，以甘露糖濃度(mg/ml)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，甘露糖標準曲線為A=14.03C+0.005139(r=1.0000)，在濃度為0.01031～0.2062 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2。

圖1 甘露糖和蘆薈多糖吸收曲線(λ=350～600 nm)

圖2 甘露糖標準曲線

2.4 精密度考察取同一份甘露糖標準溶液和供試品(冷藏組)，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，重復(fù)測定其吸光度6次并計算RSD。結(jié)果表明，甘露糖標準溶液吸光度A的RSD=0.20%，蘆薈多糖供試品溶液吸光度的RSD=0.13%，可見儀器精密度良好。見表1。

表1 儀器精密度考察結(jié)果(n=6)

2.5 穩(wěn)定性考察取同一份甘露糖標準溶液和供試品(冷藏組)，采用苯酚-硫酸法顯色，以試劑空白為參比，分別在顯色后0、15、30、60、90、120 min測定其吸光度并計算RSD。結(jié)果表明，蘆薈多糖供試品溶液吸光度的RSD=0.75%，可見供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

表2 供試品穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.6 重復(fù)性考察平行取蘆薈多糖供試品(冷藏組)6份，按1.2.4項下制備供試品溶液，以試劑空白為參比，測定吸光度并計算RSD。結(jié)果表明蘆薈多糖供試品(冷藏組)樣品平均含量為1.6055 mg/g，RSD=0.84%，可見苯酚法測定蘆薈多糖的重復(fù)性良好。見表3。

2.7 加樣回收考察精密稱取蘆薈鮮藥汁(冷藏組)5 g，平行6份，按重復(fù)性平均含量加入100%甘露糖對照品，按1.2.4項下制備供試品溶液，以試劑空白為參比，測定吸光度并計算甘露糖含量和回收率。結(jié)果表明，回收率范圍為95.06%～103.22%，符合規(guī)定。見表4。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果(n=6)

2.8 樣品測定分別對物理保鮮組和化學(xué)保鮮組的蘆薈鮮藥汁中蘆薈多糖含量進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示各組的蘆薈多糖含量與時間呈顯著性負相關(guān)(|r|>0.95，α=0.05)。

2.8.1 物理組蘆薈多糖含量變化與常溫組蘆薈鮮藥汁相比，冷藏組和冷凍組顯著性抑制蘆薈多糖的降解(P<0.001)。冷藏組和冷凍組相比，在30 d內(nèi)樣品的蘆薈多糖含量無顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

圖3 物理保鮮方法的比較(***，P<0.001)

2.8.2 化學(xué)保鮮各組蘆薈多糖含量變化檸檬酸組：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與0.5%檸檬酸組相比，1.0%和1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。與1.0%檸檬酸組相比，1.5%檸檬酸組的蘆薈多糖含量變化無顯著性差異(P>0.05)。抗壞血酸組：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與0.5%抗壞血酸組相比，1.0%和1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。1.5%抗壞血酸組的蘆薈多糖含量與1.0%抗壞血酸組相比無顯著性差異(P>0.05)。亞硫酸鈉組：與對照組(4±2) ℃相比，0.5%、1.0%和1.5%亞硫酸鈉組的蘆薈多糖含量變化均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與0.5%亞硫酸鈉組相比，1.0%和1.5%亞硫酸鈉組的蘆薈多糖含量變化具有顯著性差異(P<0.001)。1.5%亞硫酸鈉與1.0%亞硫酸鈉相比，可顯著抑制蘆薈多糖含量變化(P<0.001)。各組最優(yōu)保鮮濃度的比較：結(jié)合蘆薈多糖含量變化和成本節(jié)約，從檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉各組篩選最優(yōu)濃度(檸檬酸組1.0%，抗壞血酸1.0%，亞硫酸鈉1.5%)，兩兩比較進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，與1.0%抗壞血酸，1.5%亞硫酸鈉相比，1.0%檸檬酸顯著性抑制蘆薈多糖的降解(P<0.001)。見圖4～5。

圖4 各化學(xué)保鮮組蘆薈多糖變化趨勢圖(***，P<0.001)

圖5 各組最優(yōu)化學(xué)保鮮濃度的比較分析(***，P<0.001)

2.8.3 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果取本品190304、190308和190315三個批號的樣品，在(4±2) ℃、相對濕度為(60±10)%的條件下放置30 d，每隔2 d取樣考察外觀性狀和蘆薈多糖含量。測定結(jié)果顯示，蘆薈鮮藥汁在30 d保存期內(nèi)均呈黃綠色黏稠液體，具特殊臭味，未見變色腐敗等現(xiàn)象，蘆薈多糖含量變化見表5。

3 討論

本實驗利用苯酚-硫酸法測定蘆薈鮮藥汁的多糖含量，以往研究的蘆薈多糖測定主要以葡萄糖為標準[14, 15]，同時有研究指出甘露糖是蘆薈多糖的主要成分[16]，本研究以甘露糖為標準考察本院制劑蘆薈鮮藥汁的最優(yōu)保鮮技術(shù)。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性良好(RSD=0.84%)，回收率范圍符合規(guī)定，可準確地測定制劑中蘆薈多糖的含量。

表5 樣品長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=2)

通過比較蘆薈鮮藥汁在常溫、冷藏(T=4 ℃)和冷凍(T=-18 ℃)條件下的蘆薈多糖含量變化，結(jié)果表明低溫環(huán)境可顯著抑制蘆薈鮮藥汁的多糖含量降解(P<0.001)，故降低保存溫度可有效保留鮮藥汁的有效成分。對比冷藏組和冷凍組，二者在30 d內(nèi)蘆薈多糖含量變化趨勢一致，無顯著性差異(P>0.05)，從節(jié)省能源的角度考慮，故物理保鮮方法選擇冷藏(T=4 ℃)保存。

本實驗采用檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉等防腐劑考察蘆薈鮮藥汁的化學(xué)保鮮方法，結(jié)果表明30 d內(nèi)鮮藥汁加入檸檬酸、抗壞血酸和亞硫酸鈉均能一定程度抑制蘆薈多糖的降解。其中檸檬酸組和抗壞血酸組的最優(yōu)保鮮濃度均為1.0%和1.5%，為節(jié)約保鮮的成本，擬選取1.0%為檸檬酸和抗壞血酸的最佳濃度，亞硫酸鈉組的最優(yōu)保鮮濃度為1.5%。通過比較各組保鮮劑的最優(yōu)保鮮濃度，發(fā)現(xiàn)相比抗壞血酸和亞硫酸鈉，檸檬酸可明顯減緩蘆薈鮮藥汁中蘆薈多糖含量降解(P<0.001)，故化學(xué)保鮮方法可選擇添加保鮮劑檸檬酸(添加濃度為1.0%最佳)保存。

由于蘆薈鮮藥汁呈流質(zhì)狀，水分高，常溫或高溫下容易出現(xiàn)酸敗等變質(zhì)現(xiàn)象，故本研究僅針對低溫保存(4±2) ℃進行穩(wěn)定性考察。長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明，樣品在(4±2) ℃、相對濕度為(60%±10%)的條件下放置30 d，各批樣品的蘆薈多糖含量均出現(xiàn)明顯下降，下降幅度達35%以上，存放時間達14 d后，蘆薈多糖含量降至90%以下，根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015版與《原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則》規(guī)定[17]，本院制劑蘆薈鮮藥汁有效期暫定為14 d。

根據(jù)物理保鮮和化學(xué)保鮮結(jié)果，蘆薈鮮藥汁成品后可采用冷藏(4 ℃)和添加1.0%檸檬酸加以保存，該方法可有效預(yù)防鮮藥腐敗變色，并抑制產(chǎn)品中蘆薈多糖的分解，有利于產(chǎn)品穩(wěn)定貯存，保證制劑蘆薈鮮藥汁的合理療效和安全使用。