毛細管電泳測定尿液中7種核苷含量

曹志龍

（武警兵團總隊醫院 新疆 烏魯木齊 830011）

核苷，作為維持細胞生命活動所需的基本物質是核酸的主要組分，核苷及其衍生物均具有顯著的生理功能[1]，機體中除含有基本的正常代謝核苷（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶）外，還有大量修飾核苷，包括次黃嘌呤、假尿核苷等。修飾核苷[2-3]是正常核苷在機體內特異酶作用下生成的不易被磷酸酯化的產物。修飾核苷十分穩定，在尿中可以被定量排泄，因此尿中修飾核苷的排泄往往反映了機體RNA降解速率。正常人核苷排放濃度差異很小，但當機體發生病理性變化如細胞癌變時，核糖核酸周轉會加快，尿液中各種修飾核苷的含量相應增加，因此定量快速分析各種核苷類成分的含量可以對癌癥的發病進行診斷[4-6]。

高效液相色譜技術是最常見的分析尿中核苷的分析方法。蔣玉萍[7]等采用反相高效液相色譜法分別對宮頸癌、卵巢腺癌、卵巢胚胎癌患者尿中假尿核苷的水平進行測定，結果顯示尿中假尿核苷可以作為區分良性、惡性卵巢腫瘤的重要標志物。近年來，高效毛細管電泳分析技術由于有著分離效率高、分析時間短、樣品用量少、自動化程度高等優點已被廣泛應用于尿液、中藥等物質中核苷類化合物的分析[8-10]。

本文采用高效毛細管電泳法對尿液中7種核苷類成分進行定性定量分析，希望建立一種快速檢測尿液中核苷的分析方法，為癌癥患者的早期確診及于臨床監測提供數據支持。

1.儀器與材料

1.1 儀器

Beckman P/ACE MDQ型高效毛細管電泳儀,配二極管陣列檢測器(DAD)及32Karat軟件控制儀器操作（美國）；雷磁PHS-2F型酸度計(上海精科公司)；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo十萬分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，SIGMA2-16K型離心機。

1.2 材料

對照品：胸苷(Thymidine 批號：1001419412)、尿苷 (uridine批號：10002581110)，鳥嘌呤 (uracil，批號10002541230)，次黃嘌呤(hypoxanthine批號1001392974），鳥苷 (guanosine批號1001229937)，胸腺嘧啶(thymine 批號1012253008)，腺苷（adenosine批號：10001235421）以上對照品均購自SIGMAALDRICH公司（純度均大于98%）。硼砂，氫氧化鈉，磷酸二氫鈉，無水乙醇，以上試劑均為分析純。實驗用水均為超純水(Millipore)。

健康志愿者尿樣： 由新疆醫科大學第三附屬醫院提供。

2.方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

用十萬分之一分析天平分別精密稱取放置于干燥器中的鳥嘌呤，胸苷，胸腺嘧啶、鳥苷、次黃嘌呤、腺苷、尿苷10mg，置10mL容量瓶中加水超聲溶解并定容，搖勻得各對照品儲備液。精密吸取各儲備溶液適量至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成7種對照品質量濃度為100μg/mL混合對照品溶液。

2.2 樣品處理

收集受試者24h尿樣5mL，立刻放入-20℃的冰箱中凍存。測定前于室溫下溶解后，精密移取200μL至于超濾離心管中，使用低溫離心機12000r?min-1，4℃離心15min，將上清液轉出，作為供試品溶液備用。

2.3 電泳條件

未涂層標準熔融石英毛細管(75μm×64.5cm，有效長度56cm；檢測波長254nm；壓力進樣5kPa，5s；電壓20kV；毛細管溫度25℃；運行緩沖液：100mmol?L硼砂（Ph9.36）；毛細管使用前以0.1mol/L鹽酸，蒸餾水，0.1moL/L氫氧化鈉溶液、蒸餾水和運行緩沖液依次通過壓力沖洗3min，上述試劑使用前均經 0.45μm微孔濾膜濾過，并超聲脫氣。

2.4 樣品中各核苷峰的確定

將尿樣中未知峰的遷移時間與混標中各核苷組分的遷移時間做對照，并將單個核苷組分的標準溶液分別加入到尿樣中對比峰面積的變化用于定性。

2.5 標準曲線定量、檢測限與定量限

精密吸取混合對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于 10mL量瓶中用水定容至刻度，將稀釋好的不同濃度的混合標準溶液進樣分析，建立核苷濃度與峰面積的標準曲線，線性回歸方程及相關系數見表1，色譜圖見圖1。

表1 7種核苷對照品標準曲線、檢測限

2.6 精密度、穩定性實驗

取固定濃度的混合標準品溶液，重復進樣5次，分別測得7種指標性核苷成分峰面積的RSD值，考察精密度，結果見表2，由表2見相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

取尿液樣品，分別在0，2，4，8，12h進樣5次，測得7種核苷成分相對峰面積的RSD均5.0%，表明穩定性良好，見表3。

表2 混合標準品中7 種核苷精密度實驗

表3 樣品中7 種核苷穩定性實驗

2.7 加樣回收率實驗

精密移取已知濃度的尿液樣品，加入一定濃度的對照品溶液，按“2.3”項下供試品液制備方法制備加樣回收供試品溶液，并按照樣品測定方法進樣分析，計算回收率，見表4。

表4 加樣回收率

2.8 樣品分析

將供試品液按照“2.3”電泳條件下，進樣分析。根據7種成分的線性回歸方程計算尿液中胸苷，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，腺苷，次黃嘌呤，鳥苷，尿苷7種核苷的含量，見表5。

表5 尿液中核苷含量

3.討論

由于核苷在pH接近中性時是不帶電的，因此本次試驗選擇在堿性條件下對核苷進行分離，本實驗采用硼砂作為電泳分離的緩沖液體系。配制了不同濃度的硼砂緩沖溶液，考察濃度對分離的影響。結果表明：當硼砂濃度為20mmol/L～100mmol/L時，被分析物能得到基本分離，雖然遷移時間會隨著硼砂濃度的增高而延長，但分離度會逐漸改善，最終實驗選擇100mmol/L的硼砂作為分離體系。

pH會影響帶電組分遷移的速度及電滲流的大小，從而影響被測物的遷移時間及分離度。在硼砂緩沖體系中考察了pH9.0～10.0的范圍，結果顯示，在pH9.36條件下各組分能得到基線分離，因此最終選擇9.36作為最佳條件。

電壓對被分析物的遷移時間及分離度的影響很大，是～個重要的參數。電壓升高時，被測物遷移速度變快，從而遷移時間縮短，可節省時問，利于快速分離。但當電壓增加到一定程度時，則被測物的分離度會下降，基線會出現漂移。通過實驗考察，最終選擇的工作電壓為20kV，在此電壓下，核苷的分離效果良好。

尿液中核苷的測定被認為是評價腫瘤患者病程輕重的重要指標。目前文獻報道的方法多為高效液相色譜法，樣品制備需要經過過濾，離心，調節pH甚至富集等多個環節，這種處理方法可能造成待測物質丟失或引入新的污染物質，且回收率低。本實驗采用樣品直接經超濾離心管低溫高速離心后，直接進樣分析測定，方法學驗證顯示此方法精密度、穩定性、回收率均符合要求，具有簡單、快速的特點，采用生物樣本尿液進行測定可以對尿液中7種核苷進行定量計算，用在臨床標本檢測中。但是由于尿液中7種核苷成分含量差異顯著，因此有個別核苷測定值超出了線性范圍，應該在后續的研究中重點討論。