特應性皮炎患者外周血T細胞亞群及相關細胞因子的檢測結果分析

趙曉嵐 劉玉梅 田歆

（廣州市皮膚病防治所皮膚科 廣東 廣州 510030）

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，初發于嬰兒期及兒童期早期，呈慢性經過，患兒伴發過敏性鼻炎或哮喘。研究發現，AD的患病率呈逐年上升的趨勢，大部分患者病情可遷延至成年，嚴重影響了患者及其家庭成員的生活質量[1]。目前AD的病因及發病機制比較明確，一般認為是在一定遺傳背景和(或)環境因素作用下，造成機體皮膚屏障功能障礙或直接引起機體的免疫反應失調，導致變應性或非變應性炎癥反應。其中各種T細胞亞群及細胞因子在AD的發生發展過程中發揮了重要的作用[2-3]，本文分析AD患者外周血T細胞亞群及相關細胞因子的檢測結果及意義。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1診斷標準 Williams診斷標準的AD確診標準所需具備的必要條件為有皮膚瘙癢史，并有下列5條其中三條或者三條以上：①既往有過敏性鼻炎史或哮喘史（或一級親屬存在4歲以下兒童發生AD史）；②屈側皮膚受累史，包括踝前、腘窩、肘窩或圍繞頸周（低于10歲的兒童還包括頰部）；③全身皮膚干燥史；④發病時間為2歲前（適用于4歲以上者）；⑤屈側有濕疹（或4歲以下兒童頰部、前額和遠端肢體濕疹）[4]。

1.1.2納入和排除標準 2歲≤年齡≤60 歲，性別不限，符合Williams的診斷標準。無嚴重內科疾病及精神科疾病，排除妊娠及哺乳期婦女，近1周內停服抗組胺藥、近1月內未接受系統性糖皮質激素、免疫抑制劑治療。

1.1.3病例資料 選取本院2018年1—12月期間收治的40例AD患者作為研究組，所有AD患者符合Williams診斷標準；對照組為不患有AD及無家族過敏史的健康志愿者40例，研究組年齡4～60歲，平均年齡(16.40±6.41)歲，其中男性22例，女性18例；對照組年齡3～55歲，平均年齡(20.20±3.28)歲，其中男性21例，女性19例；兩組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

分別取兩組患者空腹狀態下的外周靜脈血共計6ml，分別置于兩支試管中：

第一只試管首先用肝素進行抗凝操作，再借助流式細胞儀（型號：賽默飛Attune NxT，廠家：廣州吉源生物科技有限公司）的幫助進行有關CD4+、CD8+的檢測工作。將一支流式管設置為樣品測試管，將約為100μl的抗凝全血置于該試管中，依次加入CD4-RD1/CD8-ECD抗體，抗體量為10μl，在室溫的溫度條件下，確保避光保護確切的情況下將上述混合液渦旋混勻，孵育約15分鐘取出試管，將500μl的紅細胞裂解液緩緩加到試管中，而后仍要在室溫的溫度條件下，確保避光保護確切的情況下將上述混合液渦旋混勻約10分鐘，再以1200轉/分鐘的轉速進行離心，時間控制在5分鐘，離心完成后棄去上清液，將2ml的PBS緩緩加入到試管中，重復渦旋混勻，保持上述以1200轉/分鐘的轉速不變，再次離心，時間仍控制在5分鐘，離心完成后棄去上清液，將500μl的PBS輕柔的加入到試管中，確?；靹颍跍囟葹?℃，避光保護的條件下，完成上機檢驗[5]。

第二只試管借助ELISA法相關原理完成對外周靜脈血中的IL-4、IL-10、IL-12的檢測。首先以1200轉/分鐘的轉速對待檢標本進行離心，時間控制在5分鐘，之后小心的將上層血清緩緩注入到EP管內；再分別設置空白孔、標準孔、待測樣品孔以準備完成加樣操作。首先將100μl樣品稀釋液緩緩加入到空白孔內，將同樣量的標準品或待測樣品加入到剩余兩個孔內，再將樣品加入到酶標板孔底部，在37℃的溫度條件下反應2小時，將孔內的液體一一棄去并甩干，無需進行洗滌，之后將100μl生物素標記抗體工作液加入到每個孔內，洗板3次，每次將其完全浸泡2分鐘左右，200μl/孔甩干。取100μl辣根過氧化物酶標記親和素工作液緩緩加入到每個孔內，在37℃的溫度條件下孵育1小時，再次將孔內的液體一一棄去并甩干，并洗板5次，每次將其完全浸泡2分鐘左右，200μl/孔甩干。按照順序將90μl的底物溶液依次加入到每個孔內，在37℃的溫度條件下避光顯色，為終止反應，需按照順序將90μl的底物溶液依次加入到每個孔內，再按照順序借助酶聯儀的輔助在450nm的波長設定條件下測量各孔的光密度[6-7]。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1外周血不同T細胞亞群占比比較，具體評價標準包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

1.3.2外周血不同細胞因子表達情況比較，具體評價標準包括IL-4、IL-10、IL-12。

1.4 統計學處理

數據采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 觀察對比兩組受試者外周血不同T細胞亞群占比情況

研究組患者的CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對照組，但CD8+水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組受試者外周血不同T細胞亞群占比情況（±s）

表1 兩組受試者外周血不同T細胞亞群占比情況（±s）

組別nCD4+CD8+CD4+/CD8+研究組4049.43±9.2314.78±3.822.82±0.74對照組4031.87±4.8929.92±4.021.42±0.51 t 20.98318.24412.983 P 0.0000.0060.015

2.2 觀察對比兩組受試者外周血不同細胞因子表達情況

研究組患者的IL-4、IL-10的表達水平顯著高于對照組，而IL-12的表達水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者外周血不同細胞因子表達情況比較（±s，pg/ml）

表2 兩組受試者外周血不同細胞因子表達情況比較（±s，pg/ml）

組別nIL-4IL-10IL-12研究組404.04±0.746.32±1.161.01±0.64對照組400.89±0.211.45±1.216.89±1.03 t 18.87216.03415.982 P 0.0180.0240.027

3.討論

特應性皮炎（AD）是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，初發于嬰兒期及兒童期早期，呈慢性經過，患兒伴發過敏性鼻炎或哮喘[8-9]。研究發現，AD的患病率呈逐年上升的趨勢，大部分患者病情可遷延至成年，嚴重影響了患者及其家庭成員的生活質量。目前認為AD的發生可能與患者免疫機制異常存在密切的關聯性，T淋巴細胞在人體免疫細胞中占有重要的地位，它包括CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞，這兩種淋巴細胞分泌出多種的細胞因子參與機體免疫反應[10]。將CD4+T淋巴細胞群分為輔助性T細胞（T helper cells，Th）和免疫抑制性調節T細胞（regulatory T cells，Treg）[11]。通常Th細胞通過啟動或維持免疫應答在AD發病機制中發揮作用，而Treg細胞通過減弱免疫應答負責維持免疫穩態和外周不耐受。AD皮損浸潤的CD4+T淋巴細胞主要是Th細胞，它參與了細胞介導的炎癥反應從而影響了AD的發生發展[12-13]。CD8+T淋巴細胞分為抑制性T細胞（suppressor T cell，Ts）及殺傷T細胞（killer T cell，Tc）。Ts細胞抑制Th細胞活性，Tc細胞具有殺傷靶細胞活性的作用，從而間接抑制B細胞的分化，對體液免疫和細胞免疫起負向調節的作用[14]。在細胞因子方面，CD4+T淋巴細胞可分泌IL-4，IL-10。初始CD4+T淋巴細胞可以直接轉化為Th9細胞。Th9細胞具有促炎作用。IL-4和IL-10協同作用下誘導Th9產生增多，從而加重了炎癥期間的組織損傷。CD8+T淋巴細胞可分泌IL-12，IL-12可協同刺激Th細胞去產生IFN-γ，從而抑制Th細胞和IgE合成[15]。正常情況下，兩種淋巴細胞比例恰當，相互協助，共同參與并維持體液免疫與細胞免疫的平衡，這些細胞因子通過細胞間接觸抑制作用促進了AD的發生發展。而本文證實研究組患者的CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對照組，但CD8+水平顯著低于對照組，這說明AD患者存在著免疫紊亂，患者機體內的細胞免疫與體液免疫失衡，細胞與體液免疫免疫相比，前者在AD患者體內占有優勢，兩種淋巴細胞比例失衡導致其分泌的細胞因子失衡，研究組患者的IL-4、IL-10的表達水平顯著高于對照組，而IL-12的表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）。綜合兩組受試者外周血不同T細胞亞群的占比情況與外周血不同細胞因子的表達情況，我們發現AD患者存在著一定的免疫異常。

綜上所述，特應性皮炎患者存在著較為嚴重的免疫紊亂，患者機體內的細胞免疫與體液免疫失衡。