己酸菌對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

張華東，李霄霄，任雪，張穎，肖冬光

(天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，工業發酵微生物教育部重點實驗室， 天津科技大學 生物工程學院，天津 300457)

己酸菌是一類革蘭氏陰性菌，厭氧或者兼性厭氧[1]，在白酒生產中己酸菌多棲息在窖泥中，己酸菌產生的己酸可以與乙醇酯化成為己酸乙酯，白酒中的己酸乙酯大部分是由乙醇和己酸酯化生成[2]，己酸乙酯是我國濃香型白酒的主體香味成分[3]，己酸菌在濃香型白酒中的地位不言而喻。己酸菌液在灌窖、養護窖池、做人工窖泥方面都有重要的作用[4,5]。在窖泥中篩選的己酸菌多為克氏梭狀芽孢桿菌，該菌多利用乙醇和乙酸為碳源，丁酸為前體物合成己酸，也有學者篩選到能利用乳酸為碳源合成己酸的瘤胃菌CBP6菌株[6-8]。

白酒的生產需要眾多微生物菌群的參與，其中酵母菌是酒精發酵的主體菌，特別是釀酒酵母，隨著發酵的進行，釀酒酵母在白酒生產過程中逐漸成為優勢菌群。有研究表明釀酒酵母可以提高己酸菌的己酸產量[9]，向己酸菌培養基中添加生香酵母有利于己酸菌的生長及代謝[10]。但是，己酸菌的主要代謝產物己酸對微生物的毒害作用也比較明顯。

白酒生產從本質上說就是微生物相互作用的結果，研究微生物間相互作用對探究白酒生產機理及白酒生產技術的進步具有重大意義[11]。實驗室前期通過分子手段獲得了一株高產酯釀酒酵母MY-15，該菌株不僅能夠高產乙酸乙酯和乙酸異戊酯，而且生長及酒精發酵性能與普通釀酒酵母沒有區別。將己酸菌與高產酯釀酒酵母MY-15進行混合發酵，研究兩株菌之間的相互作用，探究己酸菌對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響，為高產酯釀酒酵母的實際應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

己酸菌復合液：某酒廠提供；高產酯釀酒酵母MY-15(CGMCC No.5635)：天津市工業微生物重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀(均為分析純)：天津市北方天醫化學試劑廠；乙酸鈉、酵母膏、硫酸鎂、硫酸銨、碳酸鈣、乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；耐高溫α-淀粉酶(1×105U/mL)、糖化酶(2.9×105U/mL)、酸性蛋白酶(5×104U/mL)：諾維信(中國)生物技術有限公司；玉米粉：購于超市；澳洲高粱：北京紅星二鍋頭有限公司。

1.3 培養基

己酸菌培養基：乙酸鈉5 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸銨0.5 g，去離子水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min，接菌時添加2%乙醇和1%經干熱滅菌的碳酸鈣。

高產酯釀酒酵母種子培養基：玉米粉與水按1∶4(g/mL)混合，添加耐高溫α-淀粉酶(10 U/g原料)90 ℃水浴1 h，然后繼續加熱煮沸，維持 30 min，在之后補水至原體積，立即降溫到60 ℃，添加糖化酶(250 U/g原料)在60 ℃水浴4 h，然后用4層紗布過濾，調節糖度為12 °Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，115 ℃高溫滅菌20 min備用。

高粱汁發酵培養基：高粱粉與按水1∶3(g/mL)混合，液化糖化步驟同玉米粉水解液，糖化完成后降溫到40 ℃，添加酸性蛋白酶(30 U/g原料)水浴4 h，然后用4層紗布過濾，在115 ℃高溫滅菌20 min備用。

1.4 主要儀器與設備

MS204S電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋 天津市中環實驗器材有限公司；H1650-W型高速冷凍離心機 湖南湘儀科技有限公司；BX43型生物顯微鏡 日本OLYMPUS會社；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.5 試驗方法

1.5.1 己酸菌菌懸液對高產酯釀酒酵母的影響

將4 ℃冰箱保存的己酸菌液按照10%(V/V)的接種量接種到新鮮的己酸菌培養基中，在35 ℃培養96 h，取150 mL培養液，于4 ℃離心，棄掉上清液后添加無菌水補充體積至150 mL重懸菌體，制成己酸菌菌懸液。

將己酸菌菌懸液按照0，5，10，15，20 mL的接種量接種到高粱汁培養基中，高產酯釀酒酵母接種量為10 mL，發酵總體積為130 mL/250 mL，在30 ℃靜置發酵72 h。

1.5.2 己酸菌發酵液對釀酒酵母的影響

己酸菌厭氧培養9 d，獲得己酸菌發酵液，離心取上清，上清液過膜除菌，測定己酸含量(9.53 g/L)，然后用己酸發酵上清液配制含有不同己酸濃度(45，90，150，220 mg/L)的高粱汁發酵培養基，高產酯釀酒酵母MY-15接種量為10 mL，發酵總體積為130 mL/250 mL，在30 ℃靜置發酵72 h。

1.6 分析方法

己酸檢測：將樣品離心并用0.22 μm的濾膜過濾到液相分析小瓶中，使用Agilent 1200SL 液相色譜儀，色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm)，UV檢測器，流動相為5 mmol/L 的硫酸溶液，柱溫為60 ℃，流速為0.6 mL/min，檢測時間為48 min，進樣量為20 μL。

高級醇、乙酸酯檢測：發酵液經蒸餾后的樣品使用氣相色譜法測定，色譜條件：Agilent 7890B氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器(FID)，載氣為高純氮氣，LZP930白酒分析專用毛細管柱(50 m×0.32 mm×0.25 μm)，進樣量1 μL，分流比10∶1，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，氫氣流量40 mL/min,空氣流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升溫：50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升溫到200 ℃保持5 min。

殘糖的測定：斐林試劑法[12]。

高產酯釀酒酵母RNA提?。喝“l酵對數期的發酵液2 mL，在4 ℃條件下以12000 r/min高速離心3 min，棄掉上清液，立即放入液氮中冷凍2 min，然后立即放入-80 ℃冰箱中備用。高產酯釀酒酵母RNA由諾禾致源生物信息科技有限公司提取。

2 結果與分析

2.1 己酸菌菌懸液對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

表1 己酸菌菌懸液不同添加量下MY-15的CO2排放量Table 1 CO2 emission load of MY-15 under different additive amount of caproic acid bacteria suspension g

釀酒酵母在限氧條件下，在酒化酶的作用下將葡萄糖發酵生成酒精和二氧化碳[13]，二氧化碳失重變化可以反映釀酒酵母的發酵速度，發酵過程中每隔12 h稱重一次。由表1可知，與對照相比，己酸菌菌懸液各添加量下高產酯釀酒酵母的發酵速度沒有受到影響，總失重都在9.1～9.3 g之間。

表2 己酸菌菌懸液不同添加量下高產酯釀酒酵母理化指標Table 2 Physicochemical indices of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different additive amount of caproic acid bacteria suspension

續 表

由表2可知，添加己酸菌菌懸液對高產酯釀酒酵母酯醇代謝及酒精發酵沒有直接影響，主要原因可能是高粱汁發酵培養基不適合己酸菌生長代謝，或者是與發酵時間過短有關系。

2.2 己酸菌發酵液對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

圖1 不同己酸濃度下高產酯釀酒酵母的CO2排放量Fig.1 CO2 emission load of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different additive amount of caproic acid

由圖1可知，隨著高粱汁發酵培養基內己酸濃度的升高(0～220 mg/L己酸)，高產酯釀酒酵母的發酵速度呈現先增加后降低的趨勢，當培養基內己酸濃度為90，150 mg/L時，高產酯釀酒酵母的發酵速度有明顯提高，說明培養基內含有適量的己酸菌發酵液能促進高產酯釀酒酵母的生長。

由圖2可知，培養基內己酸濃度為45～220 mg/L時，高產酯釀酒酵母發酵72 h后的乙醇有略微提高，在己酸濃度為220 mg/L時高產酯釀酒酵母的乙醇為81.13 g/L，比己酸濃度為0 mg/L時增加了6.64%。發酵72 h后的殘糖呈現降低的趨勢，在己酸濃度為0，45，90，150，220 mg/L時，殘糖分別為5.4，5.3，5.2，5，5 g/L。說明培養基內含有少量己酸菌代謝產物可以促進高產酯釀酒酵母的乙醇代謝。

圖2 不同己酸濃度下高產酯釀酒酵母的乙醇及殘糖差異Fig.2 Differences in ethanol and residual sugar content of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different concentration of caproic acid

圖3 不同己酸濃度下高產酯釀酒酵母主要風味物質含量Fig.3 Content of main flavor substances in Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different concentration of caproic acid

由圖3可知，培養基內的己酸濃度微量時(45 mg/L)對釀酒酵母酯醇代謝的影響很大，乙酸乙酯分別下降39.18%、55.1%、56.35%、65.32%。乙酸異丁酯在己酸濃度為45 mg/L時下降78.57%，己酸濃度為90 mg/L時，乙酸異丁酯含量下降91.32%，在己酸濃度為150，220 mg/L時沒有檢測到乙酸異丁酯。乙酸異戊酯含量也隨著培養基內己酸濃度的升高而降低，分別下降64.28%、78.05%、80.79%、82.14%。正丙醇含量在己酸濃度為220 mg/L時變化最大，下降了65.85%，在其他己酸濃度下正丙醇分別下降10.24%、7.07%、18.55%。異丁醇在培養基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時分別下降32.43%、48.64%、56.76%、58.13%。異戊醇在培養基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時分別下降18.75%、58.03%、67.85%、67.55%。隨著培養基內己酸濃度的增加，苯乙醇的含量下降最為明顯，在己酸濃度為45 mg/L時，苯乙醇已經下降了77.46%，在培養基己酸濃度為90，150，220 mg/L時分別下降92.95%、92.97%、94.36%。活性戊醇在培養基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時分別下降27.27%、69.09%、76.36%、85.47%。

2.3 己酸菌代謝產物對高產酯釀酒酵母轉錄組的影響

選取己酸濃度為220 mg/L為實驗組(編號Cap)，不添加己酸濃度的為對照組(編號MY-15)。對數期取樣送達諾禾致源生物有限公司進行轉錄組測序。

火山圖可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，見圖4。圖4中橫坐標表示基因在處理和對照兩組中的表達倍數變化(log2 Fold Change)，縱坐標表示基因在處理和對照兩組中表達差異的顯著性水平。右側1.301域值線表示上調基因數，左側1.301域值線表示下調基因數，域值線以下表示沒有明顯變化的基因數。

由圖4可知，在培養基內含有己酸菌代謝產物時(己酸濃度為220 mg/L)，高產酯釀酒酵母共有1032個基因上調，有1037個基因下調。

圖4 差異基因火山圖Fig.4 Differential gene volcano map

GO(Gene Ontology，基因本體)是描述基因功能的綜合性數據庫，主要是利用基因的本質功能對基因進行分類，從而限定和描述基因和蛋白質的功能。GO數據庫把基因的本體分為3種：生物過程(Biological Process，BP)、細胞組成(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function,MF)。從GO富集分析結果中，選取最顯著的30個Term繪制柱狀圖進行展示，若不足30個，則繪制所有Term，見圖5。圖5中橫坐標為GO Term，縱坐標為GO Term富集的顯著性水平，數值越高越顯著，從左到右分別代表BP、CC、MF 3個GO子類。

圖5 GO富集分析柱狀圖Fig.5 GO enrichment analysis histogram

由圖5可知，添加己酸菌代謝產物后，主要影響了翻譯、肽生物合成過程、酰胺生物合成過程、細胞酰胺代謝過程、肽代謝過程、有機氮化合物生物合成工藝、有機氮化合物代謝過程、細胞蛋白質代謝過程、蛋白質代謝過程、細胞復合氮生物合成過程、細胞大分子生物合成過程等生物過程；主要影響了核糖體、細胞內核糖核蛋白復合物、核糖核蛋白復合物、無膜細胞器、細胞內無膜細胞器、細胞質部分、高分子絡合物、細胞質的細胞組成等；主要影響了核糖體的結構組成、結構分子活性等分子功能。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書)，是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的數據庫。從KEGG富集結果中，選取最顯著的20個KEGG通路繪制散點圖進行展示，見圖6。圖6中橫坐標為注釋到KEGG通路上的差異基因數與差異基因總數的比值，縱坐標為KEGG通路，點的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數。

圖6 KEGG富集散點圖Fig.6 KEGG enrichment scatter plot

由圖6可知，添加己酸菌發酵液至培養基中己酸濃度為220 mg/L時，與不添加己酸菌發酵液相比，高產酯釀酒酵母的核糖體、苯丙氨酸代謝、糖酵解、碳代謝、氧化磷酸化、酪氨酸代謝、氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝過程受到顯著影響。

3 結論

己酸菌菌懸液對高產酯釀酒酵母的生長、酒精發酵及酯醇代謝沒有直接影響，但是己酸菌的代謝產物對高產酯釀酒酵母的影響顯著，少量己酸濃度(90～220 mg/L)能促進高產酯釀酒酵母的生長及酒精發酵，酒精產量最多提高了6.63%，但是在己酸濃度為45～220 mg/L時，高產酯釀酒酵母的乙酸酯和主要高級醇的代謝被顯著抑制，且隨著己酸濃度的提高，抑制作用越來越強烈。

將己酸濃度為220 mg/L的高產酯釀酒酵母與不添加己酸的高產酯釀酒酵母進行轉錄組測序表明，高產酯釀酒酵母共有1032個基因上調，有1037個基因下調，主要涉及到高產酯釀酒酵母的氮代謝、糖酵解、苯丙氨酸代謝、碳代謝等生物過程。