微波輔助低共熔溶劑提取桑葚果渣花青素的工藝研究

欒琳琳，盧紅梅*，陳莉，吳煜樟

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴陽 550025；2.貴州大學貴州省發(fā)酵工程 與生物制藥重點實驗室，貴陽 550025)

桑葚(mulberry)是?？粕?MorusalbaL.)多年生木本植物桑樹的果實，又稱桑椹、桑棗、桑果等，被國家衛(wèi)生部列為首批藥食同源植物，被譽為“21世紀最佳保健果品”[1]，桑葚中的花青素是其主要的生物活性成分,具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值[2-5]。因此，從桑葚中提取花青素應用到食品及藥品領域具有重要意義。傳統(tǒng)花青素提取大都采用有機溶劑為提取劑，提取效率低，處理劑量大，且易污染環(huán)境，隨著人們對環(huán)境保護意識的增強，使得綠色提取成為科研人員關注的焦點。

低共熔溶劑(DES)是繼離子液體后的新一代綠色溶劑，由一定化學計量比的氫鍵受體和氫鍵供體組合而成的兩組分或三組分低共熔混合物。低共熔溶劑具有揮發(fā)性低、不易燃、無毒、價格低廉、環(huán)境友好和易制備等優(yōu)點而作為傳統(tǒng)揮發(fā)性有機溶劑的替代溶劑[6]。Bakirtzi等[7]以乳酸基低共熔溶劑為提取介質，超聲輔助提取希臘藥用植物中的抗氧化多酚；Jeong 等[8]采用低共熔溶劑高效提取人參中的主要生物活性物質人參皂苷；Zeng等[9]首次以含水兩相體系的低共熔溶劑(氯化膽堿-尿素)為介質研究用于提取牛血清白蛋白；李梅等[10]研究了利用低共熔溶劑從薏苡葉中提取總黃酮；倪玉嬌等[11]以一系列低共熔溶劑為提取劑，采用超聲波輔助法從沙棘籽粕中提取多酚。

目前，還沒有關于低共熔溶劑提取花青素的文獻報道。因此，本試驗以桑葚加工副產物果渣為原料，應用微波輔助提取技術，研究不同低共熔溶劑對桑葚果渣花青素提取量的影響，并結合 Box-Behnken設計-響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，以期在最大限度下提取花青素，為桑葚花青素綠色、高效提取提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚果渣果汁加工副產物：貴州臺今聯(lián)合農業(yè)科技有限責任公司提供，-20 ℃冷凍保藏；氯化鉀、乙酸鈉：分析純，成都金山化學試劑有限公司；鹽酸：分析純，重慶川東化工有限公司；無水乙醇、1,2-丙二醇、丙三醇：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；氯化膽堿：分析純，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、檸檬酸：分析純，天津市永大化學試劑有限公司；草酸：分析純，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；乳酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

ZD-2A型自動電位滴定儀 上海大普儀器有限公司；LD-3電動離心機 上海上登實驗設備有限公司；101-1電熱干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；HH-b型數顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司；FA2004N精密電子天平 上海菁海儀器有限公司；722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；XTP-200型高速多功能粉碎機 浙江永康市紅太陽機電有限公司；XH-100A微波催化合成/萃取儀 北京祥鴿科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理

取冷凍保藏的桑葚果渣于50 ℃烘箱中烘干，用粉碎機粉碎成粉末，過60～80 目篩，將其裝入保鮮袋于-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 低共熔溶劑制備

參考尚憲超等[12]的方法，低共熔溶劑由氯化膽堿與不同氫鍵供體(草酸、1,2-丙二醇、丙三醇、乳酸、檸檬酸、葡萄糖)按一定摩爾比混合放置于圓底燒瓶中，80 ℃恒溫水浴一定時間，直至得到無色透明液體，冷卻至室溫后，制得低共熔溶劑。

1.2.3 提取方法

準確稱取0.5 g桑葚果渣粉末于提取器中，加入一定量低共熔溶劑，混勻，一定條件下微波提取，提取液轉移至離心管內，4000 r/min離心10 min，上清液即為桑葚果渣花青素粗提液。

1.2.4 單因素試驗

稱取0.5 g桑葚果渣粉末，分別在低共熔溶劑類型(DES-1、DES-2、DES-3、DES-4、DES-5、DES-6)、加水量(0%、20%、30%、40%、50%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，g/mL)、微波功率(400，500，600，700，800 W)、微波溫度(30，40，50，60，70 ℃)、微波時間(30，40，50，60，70 s)條件下進行單因素試驗。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗

通過單因素試驗的結果，以花青素提取量為考察指標，依據Box-Behnken設計原理，選擇微波功率、微波溫度和微波時間進行三因素三水平響應面試驗，確定最優(yōu)工藝參數見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 花青素含量的測定

1.2.6.1 pH 1.0緩沖液的配制

準確稱取3.725 g KCl用蒸餾水稀釋并定容至250 mL；準確量取4.25 mL濃鹽酸用蒸餾水定容至250 mL，將KCl溶液與HCl溶液以25∶67比例混合。用KCl溶液調pH為1.0±0.1。

1.2.6.2 pH 4.5緩沖液的配制

準確稱取4.1 g CH3COONa用蒸餾水稀釋并定容至250 mL，用HCl溶液調pH為4.5±0.1。

1.2.6.3 測定方法

測定過程根據Aramwit等[13]的方法稍作改動：取2.5 mL提取液，用蒸餾水定容至25 mL。移取2.5 mL樣液2份，分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液定容至25 mL，40 ℃水浴平衡30 min，以蒸餾水代替樣品做空白對照，在510 nm和700 nm處測定吸光度。

花青素含量的計算如下：

式中：A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；ε為摩爾消光系數，26900 L/(mol·cm)；L為光程，1 cm；M為原料質量，g。

1.3 數據處理與分析

采用Origin 8.6和Design-Expert V8.0.6等軟件對試驗數據進行處理，每個處理組進行3次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 低共熔溶劑種類對花青素提取量的影響

在固定摩爾比1∶1、料液比1∶50(g/mL)、微波功率700 W、微波溫度50 ℃、微波時間40 s的條件下，考察不同低共熔溶劑種類對花青素提取量的影響，結果見圖1。

圖1 提取劑對花青素提取量的影響Fig.1 Effect of extractants on yield of anthocyanins

由圖1可知，6種低共熔溶劑對花青素的提取量依次為DES-2(氯化膽堿/1,2-丙二醇)>DES-3(氯化膽堿/丙三醇)>DES-1(氯化膽堿/草酸)>DES-6(氯化膽堿/葡萄糖)>DES-4(氯化膽堿/乳酸)>DES-5(氯化膽堿/檸檬酸)。其中，DES-2(氯化膽堿/1,2-丙二醇)對桑葚花青素提取量最高，達到34.17 mg/g，而DES-5(氯化膽堿/檸檬酸)對花青素提取量最低，僅有25.74 mg/g。同時，比較DES與有機溶劑(乙醇)對桑葚花青素提取量的影響，由結果可知，DES-2對桑葚花青素的提取優(yōu)于傳統(tǒng)有機溶劑。DES能提高花青素的提取量可能是由于DES的擴散力、溶解度和極性等有利于花青素的溶出[14]，DES-2的極性與桑葚花青素的極性最為相近，能更好地與花青素分子接觸，因此，選擇DES-2作為桑葚花青素提取劑。

2.1.2 不同摩爾比例對花青素提取量的影響

在料液比1∶50(g/mL)、微波功率700 W、微波溫度50 ℃、微波時間40 s的條件下，以DES-2為提取劑，含水量為40%，考察不同摩爾比例對花青素提取量的影響，結果見圖2。

圖2 摩爾比對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of molar ratio on yield of anthocyanins

由圖2可知，當DES-2摩爾比由2∶1增大到時，花青素提取量明顯升高，這可能是由于隨著1,2-丙二醇量增加使DES粘度降低，擴散力增強，有利于花青素溶出[15]。而隨著摩爾比繼續(xù)增大，花青素提取量則降低，這是由于1,2-丙二醇量增加，DES極性變小，與桑葚花青素極性差距拉大，使得花青素提取量降低，因此，選擇DES-2摩爾比為1∶2。

2.1.3 加水量對花青素提取量的影響

DES具有較高的粘性，擴散力較低，難以滲入基質內部，因此需要添加一定量的水以降低DES的粘度[16]。在料液比1∶50(g/mL)、微波功率700 W、微波溫度50 ℃、微波時間40 s的條件下，以摩爾比1∶2的DES-2為提取劑，考察加水量對花青素提取量的影響，結果見圖3。

圖3 低共熔溶劑(DES-2)的含水量對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of water content in DES-2 on yield of anthocyanins

由圖3可知，隨著DES-2中加水量的增加，花青素提取量逐漸增加。當加水量達到30%～40%時，花青素提取量達到最大；隨著加水量繼續(xù)增加，花青素提取量降低。這可能是由于DES與花青素之間是氫鍵作用力，隨著加水量的增加，減弱了這種作用力，使得花青素提取量降低[17]。因此，選擇DES-2的加水量為30%～40%。

2.1.4 料液比對花青素提取量的影響

在微波功率700 W、微波溫度50 ℃、微波時間40 s的條件下，以摩爾比1∶2的DES-2(含水量40%)為提取劑，考察料液比對花青素提取量的影響，結果見圖4。

圖4 料液比對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on yield of anthocyanins

由圖4可知，隨著料液比的增大，花青素提取量逐漸增加。當料液比達到1∶50時花青素提取量達到最大；隨著料液比繼續(xù)增大，花青素提取量降低。其原因可能是隨著料液比增大，桑葚細胞內外濃度差增大，有利于桑葚花青素溶出；而當料液比達到1∶60后，花青素提取量變化不大，可能是花青素溶出至飽和，沒有更多花青素分離出[18]。因此，微波輔助低共熔溶劑提取花青素的最佳料液比為1∶50。

2.1.5 微波功率對花青素提取量的影響

在料液比1∶50、微波溫度50 ℃、微波時間40 s的條件下，以摩爾比1∶2的DES-2(含水量40%)為提取劑，考察微波功率對花青素提取量的影響，結果見圖5。

圖5 微波功率對花青素提取量的影響Fig.5 Effect of microwave power on yield of anthocyanins

由圖5可知，花青素提取量隨著微波功率的增大呈先上升后下降的趨勢。在微波功率小于600 W時，桑葚花青素提取量隨著微波功率增大而提高，當微波功率達到600 W時花青素提取量達到最大；當微波功率大于600 W時，花青素提取量降低。其原因可能是微波的輻射作用穿透桑葚細胞，使得細胞壁破裂，有利于桑葚花青素的溶出，當微波功率過大時，產生劇烈震動，使得花青素降解，提取量降低[19]。因此，微波輔助低共熔溶劑提取花青素最適功率為600 W。

2.1.6 微波溫度對花青素提取量的影響

在料液比1∶50、微波功率600 W、微波時間40 s的條件下，以摩爾比1∶2的DES-2(含水量40%)為提取劑，考察微波溫度對花青素提取量的影響，結果見圖6。

圖6 微波溫度對花青素提取量的影響Fig.6 Effect of microwave temperature on yield of anthocyanins

由圖6可知，桑葚花青素提取量隨著提取溫度的升高而增大，溫度升至40 ℃時，桑葚花青素提取量最高；隨著溫度進一步升高，桑葚花青素提取量開始下降。其原因可能是隨著溫度的升高，桑葚果渣粉在溶劑中的溶解和擴散能力增加，有利于花青素的溶出[20]；當提取溫度過高時，高溫導致熱敏性的花青素降解，花青素提取量下降。因此，微波輔助低共熔溶劑提取花青素的最適溫度為40 ℃。

2.1.7 微波時間對花青素提取量的影響

在料液比1∶50、微波功率600 W、微波溫度40 ℃的條件下，以摩爾比1∶2的DES-2(含水量40%)為提取劑，考察微波時間對花青素提取量的影響，結果見圖7。

圖7 微波時間對花青素提取量的影響Fig.7 Effect of microwave time on yield of anthocyanins

由圖7可知，隨著提取時間的延長，花青素提取量逐漸增加。當提取時間為40 s時，花青素提取量達到最大；隨著提取時間繼續(xù)延長，花青素提取量降低。其原因可能是隨著提取時間延長，花青素不斷溶出；而提取時間過長，導致花青素降解。因此，微波輔助低共熔溶劑提取花青素的最佳時間為40 s。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

微波輔助低共熔溶劑提取花青素響應面試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

采用Design-Expert V8.0.6軟件對數據進行回歸分析，得到回歸方程的方差分析表(見表2)，進行非線性回歸二次多項式擬合，得到二次回歸方程：

Y=-62.07+0.17A+1.40B+0.93C-0.02B2-0.01C2。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：“*”代表0.05顯著水平；“**”代表0.01顯著水平。

由表3可知，回歸方差分析顯著性檢驗表明，回歸模型極顯著(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.1208>0.05),說明建立的模型是可靠的。相關系數R2=0.9917，表明響應變量與響應值的線性關系顯著，模型擬合度較好，可用來預測桑葚花青素的提取量。

由方差分析結果可知，一次項A，B極顯著(P<0.001)，交互項AB、AC、BC均不顯著(P>0.05)，A2、B2、C2均極顯著(P<0.0001)，說明響應變量與響應值之間不是簡單的線性關系。各響應變量對桑葚花青素提取量影響大小順序為：微波溫度>微波功率>微波時間。

2.2.2 響應面分析

以響應曲面和等高線圖可以直觀地看出各因素間的交互作用對花青素提取量的影響，交互作用圖和等高線圖見圖8。

圖8 兩因素交互作用對花青素提取量影響的 響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the effect of interaction of two factors on the yield of anthocyanins

在響應面圖中，曲面越陡，說明兩因素交互作用越顯著；等高線的形狀可反映出交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由可知，微波功率(A)與微波溫度(B)、微波功率(A)與微波時間(C)及微波溫度(B)與微波時間(C)三組交互作用的等高線不密集，接近圓形，因此，交互作用AB、AC、BC對桑葚花青素提取量影響不顯著。

2.2.3 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗得到結果和回歸方程，預測試驗范圍內桑葚果渣花青素的提取最佳工藝條件為：微波功率614.05 W，微波溫度41.26 ℃，微波時間 40.46 s，在此條件下花青素提取量為36.05 mg/g?？紤]到儀器的參數限制、試驗的可操作性及成本等，將最優(yōu)工藝條件修正為：微波功率600 W，微波溫度40 ℃，微波時間40 s，在此條件下，花青素提取量的試驗驗證值為35.97 mg/g，與理論值接近，說明本研究優(yōu)化得到的桑葚果渣花青素提取工藝參數是可靠的，可擬合實際提取。

3 結論

本研究以桑葚果渣粉為原料，利用新型綠色的低共熔溶劑作為提取溶劑，以微波輔助手段對桑葚果渣中花青素進行高效快速提取。發(fā)現(xiàn)由氯化膽堿/1,2-丙二醇(摩爾比1∶2，含水量40%)組成的溶劑最適合花青素提取，比傳統(tǒng)乙醇提取法提取含量更高，且環(huán)保節(jié)能，可用于花青素類物質的提取，且為其他生物活性物質的提取提供了新思路。然而關于低共熔溶劑的后續(xù)分離問題還有待進一步探討，或可很據產物的應用屬性，選擇合適的低共熔溶劑，將提取液作為產品直接應用。