微波-亞硝基乙基脲誘變黑曲霉高產果膠酶的研究

杜國軍，張以超，彭凱，田英華，劉祥，王松

(1.齊齊哈爾大學，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省 普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

果膠酶是廣泛存在于動植物及微生物中的能分解果膠質的一種復合酶[1]。它主要應用于環境保護、飼料與食品加工、植物抗病害、紡織行業、造紙洗滌等方面。來源于動植物的果膠酶提取難、產量低，而微生物則生長條件簡單、成長快速、果膠酶產量大。因此，微生物是獲取果膠酶的主要來源方式[2,3]。自然界中真菌、放線菌、細菌等都能夠用來生產果膠酶。其中，黑曲霉是國際上公認的安全微生物菌株[4]。天然黑曲霉的果膠酶產量較低，通過簡單有效的微生物誘變菌種，可以大幅提高黑曲霉的產酶能力[5]。微波作為物理誘變劑，具有易于操作、設備簡單、高效安全等特點，化學誘變劑亞硝基乙基脲具有誘變用時短、劑量小、效果佳等優點，故本研究以微波及亞硝基乙基脲為誘變劑對黑曲霉進行復合誘變處理，采用透明圈法與固態發酵法選育出高產果膠酶性能穩定的黑曲霉突變菌株，以期為果膠酶的工業化生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉ZYC-06：齊齊哈爾大學農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室；果膠：生工生物工程(上海)股份有限公司；PB-10酸度計：賽多利斯科學儀器有限公司；微波爐：廣東格蘭仕集團有限公司；隔水培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 培養基

1.2.1 馬鈴薯培養基(PDA)

200 g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30 min，破碎，紗布過濾，加20 g瓊脂及葡萄糖，補足蒸餾水至1000 mL，pH值自然。

1.2.2 果膠培養基

2.0 g瓊脂，0.2 g果膠，0.1 g磷酸氫二鉀，0.05 g硫酸鎂，0.3 g硝酸鈉，0.001 g硫酸鐵，pH值5.5。

1.2.3 固體發酵培養基

0.25 g豆粕，10 g麩皮，0.1 g 硫酸銨，0.35 g硝酸鈉，250 mL錐形瓶，按料液比1∶1.5加入pH調至5.5的蒸餾水。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑曲霉出發菌株初篩

取1支活化好的黑曲霉ZYC-06斜面菌株，用無菌生理鹽水洗下孢子，無菌棉過濾后，置于裝有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩30 min分散孢子，制成濃度為106個/mL的均勻單孢子懸液。將單孢子懸液稀釋103，104，105，106倍，用移液槍移取100 μL接種在無菌的PDA平皿上，均勻涂布，倒置，30 ℃條件下恒溫培養5～7 d。用接菌環將單菌落接種于果膠培養基平皿，向平皿中加入5 mL盧戈氏碘液，靜止2 min后，倒出碘液，加入5 mL生理鹽水，10 min后倒出，觀察是否有透明圈產生及透明圈的大小，選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株進行復篩。

1.3.2 黑曲霉出發菌株復篩

將初篩得到的黑曲霉菌株接種于固體發酵培養基，進行固體發酵，30 ℃條件下恒溫培養4～5 d，測其果膠酶活力，選取果膠酶活力較高的作為出發菌株。

1.3.3 果膠酶活力的測定

采用DNS比色法(3,5-二硝基水楊酸法)測定果膠酶活力[6]。具體方法：繪制D-半乳糖醛酸標準曲線，得標準曲線方程。取適當稀釋的酶液0.5 mL于比色管中，加入2 mL pH 4.0的0.4%果膠溶液。45 ℃條件下恒溫水浴30 min，加入DNS溶液混勻沸水浴5 min，流水冷卻，蒸餾水定容至25 mL，520 nm測定吸光值，依據標準曲線方程計算半乳糖醛酸含量。酶活力定義為：在pH值3.0、溫度50 ℃水浴條件下，每分鐘分解果膠生成1 μmol半乳糖醛酸所需果膠酶的量為一個酶活力單位(U)。

1.3.4 黑曲霉的復合誘變處理

1.3.4.1 微波誘變處理

取1支出發菌種斜面，活化后，用無菌生理鹽水洗下孢子，經過濾、振蕩分散成單孢子懸液，加蒸餾水調整孢子濃度為106個/mL。用移液管吸取單孢子懸液，轉入平皿中，每個平皿的單孢子懸液加入量為10 mL，將盛有單孢子懸液的平皿置于功率700 W、頻率2450 Hz的微波爐中[7,8]，對單孢子懸液進行微波照射處理，時間為0，10，20，30，40，50，60，70，80 s。從平皿中吸取不同照射時間的單孢子懸液，適當稀釋后，用移液槍吸取100 μL涂布于PDA平皿，每組實驗做3個平行，30 ℃條件下恒溫避光倒置培養5 d，統計菌落存活數量，確定最適微波誘變時間。然后按照微波最適誘變時間進行處理，選取高產果膠酶的黑曲霉突變菌株。

1.3.4.2 亞硝基乙基脲誘變處理

取經微波處理后透明圈直徑與菌落直徑比值較大的黑曲霉菌株，30 ℃條件恒溫培養5 d，經過濾、振蕩分散成單孢子懸液，加蒸餾水調整孢子濃度為106個/mL。用濃度0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的亞硝基乙基脲溶液分別對單孢子懸液進行誘變處理，10 min后加入2.0%的硫代硫酸鈉溶液終止誘變。用移液槍吸取100 μL涂布于PDA平皿，每組實驗做3個平行，30 ℃條件下恒溫避光倒置培養5 d，統計菌落存活數量，確定最適亞硝基乙基脲誘變濃度。然后按照亞硝基乙基脲最適誘變條件進行處理，選取高產果膠酶的黑曲霉突變菌株。

1.3.4.3 繪制黑曲霉致死率曲線

按照公式致死率(%)=(未處理存活孢子數-處理存活孢子數)/未處理存活孢子數，計算出黑曲霉菌株的致死率，以誘變時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制出黑曲霉的致死率曲線。選擇致死率在70%～80%范圍內的處理條件作為微波及亞硝基乙基脲的最適誘變條件。

1.3.5 黑曲霉突變菌株初篩

方法同1.3.1。

1.3.6 黑曲霉突變菌株復篩

將初篩獲得的黑曲霉突變菌株接種于固體發酵培養基，30 ℃條件下恒溫培養4～5 d，每個培養基中加入25倍的蒸餾水，浸泡3 h，紗布過濾，得到黑曲霉發酵粗酶液。粗酶液加蒸餾水稀釋1000倍，采用DNS法測定其果膠酶活力，選擇果膠酶活力較高的突變株連續傳5代，測其穩定性，最終獲取正突變菌株中性能穩定且果膠酶活力高的黑曲霉突變菌株。

2 結果與討論

2.1 微波誘變時間的確定

黑曲霉出發菌株ZYC-06經微波照射，得到不同照射時間的致死率，繪制出致死率曲線，結果見圖1。

圖1 黑曲霉出發菌株ZYC-06微波誘變致死率Fig.1 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-06 by microwave mutation

由圖1可知，隨著微波照射時間的延長，黑曲霉的致死率也明顯增加。當照射時間為40 s時致死率為77%，80 s時黑曲霉菌株全部死亡，致死率達到100%。因此，黑曲霉ZYC-06的最適微波誘變時間確定為40 s。

2.2 微波誘變結果

將盛有黑曲霉ZYC-06單孢子懸液的平皿置于微波爐中誘變40 s后，果膠培養基涂布，30 ℃條件下培養5 d，采用透明圈法及固體發酵培養篩選出10株產果膠酶活力明顯大于出發菌株的突變菌株，結果見表1。

表1 微波誘變結果Table 1 The results of microwave mutation

其中，黑曲霉ZYC-A05產果膠酶活力最高，達到了1469 U/g，透明圈圖片見圖2。

圖2 黑曲霉突變株ZYC-A05Fig.2 Aspergillus niger original strain ZYC-A05

2.3 亞硝基乙基脲誘變濃度的確定

利用不同濃度的亞硝基乙基脲溶液對黑曲霉突變株ZYC-A05進行化學誘變處理，得到致死率曲線，結果見圖3。

圖3 黑曲霉突變株ZYC-A05亞硝基乙基脲致死率Fig.3 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-A05 by nitrosoethylurea

由圖3可知，隨著亞硝基乙基脲溶液濃度的增加，黑曲霉ZYC-A05的致死率也不斷增加，在0.06 mg/mL時，致死率在70%～80%之間，故黑曲霉ZYC-A05的亞硝基乙基脲最適處理濃度為0.06 mg/mL。

2.4 亞硝基乙基脲誘變結果

使用濃度為0.06 mg/mL亞硝基乙基脲對黑曲霉ZYC-A05誘變處理10 min，終止后，涂布單孢子懸液于果膠培養基，30 ℃條件下恒溫培養5 d，采用透明圈法及固體發酵培養篩選出6株產果膠酶活力明顯大于出發菌株的突變菌株，結果見表2。

表2 亞硝基乙基脲誘變結果Table 2 The mutation results of nitrosoethylurea

其中，黑曲霉ZYC-B03產果膠酶活力最高，達到了2790 U/g，透明圈圖片見圖4。

圖4 黑曲霉突變株ZYC-B03 Fig.4 Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03

2.5 突變株產果膠酶穩定性

選取產果膠酶活力最大的黑曲酶突變株ZYC-B03進一步傳代培養，連續傳代5次，對其遺傳穩定性進行檢驗，結果見表3。

表3 黑曲酶突變株ZYC-B03的傳代培養情況Table 3 The passage culture situation of Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03

由表3可知，突變株ZYC-B03在傳代5次后，產果膠酶性能穩定且活力較高，平均產果膠酶活力2780 U/g。因此，黑曲霉ZYC-B03是一株可以用來研究果膠酶的優良實驗菌種。

3 結論

本研究采用微波及亞硝基乙基脲為誘變劑，對黑曲霉ZYC-06進行誘變處理。結果表明：微波照射40 s，0.06 mg/mL亞硝基乙基脲處理10 min為最適誘變劑量，誘變后獲得1株遺傳性能穩定的黑曲霉突變株ZYC-B03，該突變株在30 ℃條件下恒溫培養5d，產果膠酶活力達到了2790U/g，是出發菌株的2.88倍。