LP-7501S用于發酵蘿卜中亞硝酸鹽降解工藝的研究

于沛，王修俊*，商景天，馮廷萃

(1.貴州大學發酵工程與生物制藥省級重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院， 貴陽 550025；3鎮遠縣名城食品廠，貴州 鎮遠 557700)

泡菜是將新鮮蔬菜利用中低濃度食鹽水進行泡漬腌制，通過前期微生物(乳酸菌為主)發酵、后期調味加工制成的產品[1]。乳酸菌是一類能夠發酵碳水化合物且產乳酸的革蘭氏陽性細菌的統稱[2]。

亞硝酸鹽(nitrite，NIT)的安全控制一直是泡菜發酵過程中的關鍵問題之一，亞硝酸鹽能使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，導致低氧血癥[3]；亞硝酸鹽在人體內會積累轉變為亞硝胺，可導致胃癌、甲狀腺癌等[4,5]。自然發酵的泡菜存在著發酵周期長、亞硝酸鹽含量不可控等問題[6]。許多研究表明乳酸菌在泡菜發酵過程中有降解亞硝酸鹽的作用[7,8]，降解機理為乳酸菌可產酸和產亞硝酸鹽還原酶[9]。故生產上常采用直投式乳酸菌發酵，使亞硝酸鹽含量可控，繼而有許多具有優良性能的乳酸菌菌株被篩選鑒定[10]。本實驗室前期就從自然發酵泡菜中篩選出一株有高效降解亞硝酸鹽功能的優勢菌株LP-7501S，現以蘿卜作為原料，利用LP-7501S進行強化發酵，以蔗糖添加量、食鹽添加量、氮源添加量、發酵時間和發酵溫度進行單因素試驗與正交試驗，研究LP-7501S降解亞硝酸鹽的最佳發酵工藝，為泡菜發酵過程中亞硝酸鹽降解及控制提供更有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗原料：蘿卜，貴陽市花溪區吉林村農貿市場。

試驗試劑：食用鹽，四川省南充順城鹽化有限責任公司；蔗糖，太古糖業(中國)有限公司；酵母抽提物(生化試劑)；亞鐵氰化鉀；乙酸鋅；冰乙酸；硼酸鈉；鹽酸；對氨基苯磺酸；鹽酸萘乙二胺。

1.1.2 試驗儀器

電熱鼓風恒溫干燥箱 上海賀德試驗設備有限公司；恒溫恒濕培養箱 上海博迅實業有限公司；722型分光光度計 上海佑科儀表儀器有限公司；酸度計 上海理達儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 發酵蘿卜中NIT降解工藝的單因素試驗

1.2.2.1 自然發酵蘿卜中總酸和NIT含量變化測定

選取外觀飽滿、無破損的新鮮蘿卜，洗凈、瀝干后切成1.5 cm3大小的正方體，裝壇，加入含4%食鹽和0.7%蔗糖的發酵液(發酵液∶蘿卜為1.5∶1)，用10%鹽水水封后于30 ℃下發酵9 d，每隔1 d取樣，根據GB/T 12456-2008中pH電位法和GB 5009.33-2016中鹽酸萘乙二胺分光光度計比色法測定樣品中總酸與NIT含量[11，12]。

1.2.2.2 糖類添加量對總酸和NIT的影響

選用0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5個濃度梯度來進行研究，試驗其余條件一致：4%食鹽，0.7%氮源，發酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.3 食鹽添加量對總酸和NIT的影響

以傳統自然發酵蘿卜中的食鹽添加量為參考指標，對3%、4%、5%、6%、7% 5個食鹽濃度梯度進行研究，試驗其余條件一致：0.7%糖，0.7%氮源，發酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.4 氮源添加量對總酸和NIT的影響

因蘿卜的組成成分中蛋白質的含量僅為1.2 mg/g左右[13]，所以氮源的添加量直接影響LP-7501S的生長繁殖，從而影響泡菜中的總酸和NIT含量。以蘿卜中蛋白質的含量為參考依據，試驗分別對0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5個氮源添加量進行研究，其余發酵條件為：4%食鹽，0.7%糖，發酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.5 發酵時間對總酸和NIT的影響

腌制天數的長短對泡菜的軟脆度及風味變化有所影響，腌制過久，口感會稍差或變得不佳[14]。以食鹽添加量為4%，糖類添加量為0.7%，氮源添加量為0.7%，發酵液中LP-7501S接種量為106CFU/mL，于30 ℃下對蘿卜發酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.6 發酵溫度對總酸和NIT的影響

試驗分別以20，26，30，33，37，40 ℃ 6個溫度梯度進行研究，其余發酵條件一致：4%食鹽，0.7%糖，0.7%氮源，發酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，發酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.3 發酵蘿卜中NIT降解工藝的正交試驗設計[15]

以單因素試驗為基礎，選取蔗糖濃度(A)、食鹽濃度(B)、氮源添加量(C)、發酵時間(D)、發酵溫度(E)5個因素按L16(45)正交表進行正交試驗，以NIT含量和總酸為指標研究LP-7501S發酵蘿卜的最佳因素，研究不同因素對發酵蘿卜中NIT和總酸含量的影響，試驗因素水平表見表1。使用SPSS軟件進行數據分析確定NIT降解的最佳發酵工藝。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 試驗結果與分析

2.1 自然發酵蘿卜中總酸和NIT含量變化

圖1 自然發酵過程中總酸含量變化Fig.1 The change of total acid content in natural fermentation process

由圖1可知，9 d內發酵蘿卜中總酸含量隨發酵時間先上升而后趨于穩定的趨勢，原因可能是乳酸菌等在發酵初期生長代謝產較多酸導致總酸含量上升，而5 d之后發酵體系中總酸含量偏高，使乳酸菌生長代謝產酸受到抑制，總酸含量趨于穩定。

圖2 自然發酵蘿卜NIT含量變化Fig.2 The change of nitrite content in naturally fermented radish

由圖2可知，在3 d內樣品中NIT含量隨發酵時間的延長而逐漸增大，NIT含量于3 d時達到最高值14.20 mg/kg；3 d后因泡菜中乳酸菌群的生長繁殖、代謝產酸和產酶，導致NIT被降解，結合圖1可知，6 d后因樣品中的總酸含量趨于穩定，NIT的酸降解途徑受到抑制，同時總酸含量偏高抑制了亞硝酸鹽還原酶的酶活性，使NIT含量趨于穩定。

2.2 糖添加量對總酸和NIT含量的影響

糖添加量對發酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結果見圖3和圖4。

由圖3可知，各組在發酵3 d內因LP-7501S的生長代謝產酸，故總酸含量呈上升趨勢；3 d時，總酸含量升高使LP-7501S生長代謝受到抑制，所以總酸含量趨于穩定。根據糖添加量的不同，在1 d內各組產酸差別較大，而到2 d后產酸差別較小。原因可能為LP-7501S在有較多糖的條件下能迅速代謝產生較多的有機酸。

圖3 糖添加量對總酸含量的影響Fig.3 The effect of sucrose additive amount on total acid content

圖4 糖添加量對NIT含量的影響Fig.4 The effect of sucrose additive amount on nitrite content

由圖4可知，在1 d內各組泡菜中NIT含量均迅速增加，結合總酸產量可得出在發酵初期，LP-7501S產酸總量相對較少，泡菜中的總酸含量低，不能抑制部分雜菌的生長代謝，導致蘿卜中硝酸鹽被還原，引起NIT含量升高，之后LP-7501S大量生長成為優勢菌株，產生大量有機酸和亞硝酸鹽還原酶，使大量NIT被降解。之后因為總酸含量較高，導致泡蘿卜中的其他雜菌生長和酶活同時受到抑制，最終使NIT含量趨于穩定。

結合圖3和圖4可知，糖添加量對LP-7501S代謝產酸和降解NIT影響較小，但是糖類的添加會影響泡菜發酵口感和風味。因此，結合表2中感官評價，從NIT、總酸、感官和經濟效益角度考慮，選用蔗糖作為實際發酵的添加糖類，最佳添加量為0.7%左右。

表2 不同糖添加量發酵蘿卜感官評價Table 2 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different sugar additive amount

2.3 食鹽添加量對總酸和NIT含量的影響

食鹽濃度對發酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結果見圖5和圖6。

圖5 食鹽添加量對總酸含量的影響Fig.5 The effect of salt additive amount on total acid content

圖6 食鹽添加量對NIT含量的影響Fig.6 The effect of salt additive amount on nitrite content

由圖5可知，在泡菜發酵過程中，發酵體系內食鹽含量越高，總酸產量越低。由圖6可知，發酵體系內食鹽含量越高，對LP-7501S降解NIT能力的抑制作用越強，原因為高鹽濃度會抑制LP-7501S產酸和亞硝酸鹽還原酶的酶活性，導致NIT降解緩慢，同時有一些耐鹽雜菌會大量繁殖，可能會使NIT產生量增多。發酵2 d后，食鹽添加量為3%、4%和5%的泡菜中的NIT含量都在1.0 mg/kg以下，結合表3中感官評價，選擇食鹽添加量為4%左右。

表3 不同食鹽添加量發酵蘿卜感官評價Table 3 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different salt additive amount

2.4 氮源添加量對總酸和NIT含量的影響

氮源對發酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結果見圖7和圖8。

圖7 氮源添加量對總酸含量的影響Fig.7 The effect of nitrogen source additive amount on total acid content

由圖7可知，在3 d內，氮源添加量越大，產酸速度越快，總酸含量增加越迅速。

圖8 氮源添加量對NIT含量的影響Fig.8 The effect of nitrogen source additive amount on nitrite content

由圖8可知，氮源添加量越多，NIT降解速度越快，原因可能是大量的氮源能使LP-7501S在短時間內迅速生長繁殖，成為優勢菌株，產生大量有機酸。但氮源過多會導致兩大不利因素：一是發酵速度過快，產酸過多導致泡蘿卜酸味重，影響蘿卜結構，同時氮源本身會影響泡蘿卜風味；二是氮源添加量過多會在發酵后期LP-7501S生長受抑制時導致某些雜菌大量生長，結合表4的感官評價，綜合考慮，選擇碳源的添加量為0.7%左右。

表4 不同氮源添加量發酵蘿卜感官評價Table 4 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different nitrogen source additive amount

2.5 發酵時間對總酸和NIT含量的影響

發酵時間對發酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結果見圖9。

圖9 發酵時間對總酸和亞硝酸鹽含量的影響Fig.9 The effect of fermentation time on total acid and nitrite content

由圖9可知，1～3 d內，樣品內總酸含量上升較快，NIT降解迅速，說明LP-7501S在此階段生長繁殖迅速，代謝產酸、產酶量較高；3 d以后，總酸含量趨于穩定，NIT含量也基本趨于穩定，說明LP-7501S的生長受到酸度的抑制作用。因此，綜合考慮，選擇發酵時間為3～4 d。

2.6 發酵溫度對總酸和NIT含量的影響

發酵溫度對發酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結果見圖10和圖11。

圖10 發酵溫度對總酸含量的影響Fig.10 The effect of fermentation temperature on total acid content

圖11 發酵溫度對NIT含量的影響Fig.11 The effect of fermentation temperature on nitrite content

由圖10可知，在30 ℃和33 ℃的發酵體系中總酸含量增加較快，故LP-7501S在泡菜中的適宜代謝產酸溫度應該為30～33 ℃，而由圖11可知，NIT的峰值和終值均在30～33 ℃條件下較低，分析原因可能是LP-7501S在30～33 ℃時生長繁殖迅速，在發酵體系中能迅速成為優勢菌群，同時結合圖10可知，LP-7501S在30～33 ℃條件下產酸速率最快，使生成的NIT迅速降解，同時較高的酸度抑制部分能產生NIT的雜菌生長代謝，阻斷了NIT生成。但泡菜發酵過程中，過高的溫度可能會引起一些丁酸細菌大量繁殖，產生氨等一些不良的風味物質，使泡菜成品的品質下降，故綜合考慮，以30 ℃作為LP-7501S接種發酵的最佳溫度。

2.7 發酵蘿卜中NIT降解工藝正交試驗優化結果

通過對蔗糖濃度(A)、食鹽濃度(B)、氮源添加量(C)、發酵時間(D)和發酵溫度(E)進行單因素試驗后，采用L16(45)正交表，以總酸和NIT含量為指標研究5個因素協同作用下LP-7501S在發酵體系中產酸和降解NIT的最優工藝。正交試驗優化結果見表5。

表5 正交試驗優化結果Table 5 The optimized results of orthogonal test

由表5中極差R1可知，5個因素中影響總酸含量的主次為發酵時間(D)>發酵溫度(E)>氮源添加量(C)>蔗糖濃度(A)>食鹽濃度(B)，最優的產酸工藝為A3B3C4D4E4。根據方差分析得出發酵時間對總酸影響顯著(p<0.05)。

由極差R2可知，上述5個因素中影響NIT含量的主次為發酵溫度(E)=發酵時間(D)>氮源添加量(C)>蔗糖濃度(A)>食鹽濃度(B)，最優的NIT降解工藝為A4B2C3D4E3，通過SPSS軟件對各因素進行方差分析，得出發酵溫度和發酵時間對NIT含量影響顯著(p<0.05)。

綜合產總酸和NIT含量的最優方案，A3B3C4D4E4組合的發酵溫度較高、產酸量過高，可能會影響成品風味。故選擇A4B2C3D4E3組合作為LP-7501S發酵蘿卜產酸和降解的最優工藝，即0.9%蔗糖、4%食鹽、0.7%酵母抽提物、30 ℃發酵84 h，因正交表中沒有出現這項組合，因此按A4B2C3D4E3進行3次平行試驗，測定總酸、NIT含量與感官評價，試驗結果見表6。

表6 試驗驗證結果Table 6 The result of verification test

由表6可知，在A4B2C3D4E3的降解工藝條件下，測得發酵蘿卜中總酸含量為0.73 g/100 g，NIT含量為0.432 mg/kg，感官評價為75分。

3 結論

試驗得出最優發酵工藝：蔗糖添加量為0.7%，食鹽添加量為4%，氮源添加量為0.7%，發酵時間為84 h，發酵溫度為30 ℃。在此發酵工藝條件下，總酸含量為0.73 g/100 g，發酵體系中亞硝酸鹽快速降解，含量可降至更低的水平0.432 mg/kg。得出相比自然發酵，用LP-7501S進行強化發酵，并采用最佳發酵工藝，可顯著降低亞硝酸鹽的含量，而且可明顯提高泡菜發酵過程中亞硝酸鹽的降解速度。此工藝條件下所得到的泡菜在保證口感脆嫩酸甜、香氣醇正的同時，具有更高的安全性。