基于近紅外光譜掃描技術對高粱中粗脂肪、粗纖維、粗灰分含量的測定方法研究

王勇生 李 潔 王 博 張宇婷 耿俊林

(北京市畜產品質量安全源頭控制工程技術研究中心1，北京 102209) (中糧營養健康研究院有限公司2，北京 102209) (中糧生物科技(北京)有限公司3，北京 102209)

高粱是繼水稻、小麥、玉米和大麥之后的全球第五大糧食作物(糧農組織，2015年)[1]，主要生長在相對較熱和干燥的氣候環境條件下。中商情報網報道，2015/2016年度(6月至次年5月)全球高粱產量預計為6 840萬t，遠高于上年的6 390萬t。隨著全球變暖和全球糧食產量的下降，高粱已經成為人類食品和動物飼料原料中不可缺少的資源。2016年我國高粱產量接近300萬t，進口量670萬t，總體上國內高粱進口和出口均呈上升趨勢[2]。在畜禽養殖業中豬[3-5]、肉雞[6]、鴨[7]及反芻動物生產[8,9]中，高粱越來越多地得到了使用以減少飼料的成本。

近紅外光譜技術法(NIRS) 具有無損、快速等優點，已被廣泛應用于不同的科學研究領域[10-13]，成為了不可或缺的快速準確的測定方法。玉米[14]、小麥[14]、豆粕[15]、棉粕[16]等飼料原料中營養成分的近紅外檢測方法已有報道，而高粱營養成分的近紅外分析方法鮮見報道。實驗室采用化學方法對高粱營養價值進行評估，耗費時間長、操作步驟多，而且不能實現現場或實時監測的快速檢測需要，尤其對高粱貿易采購環節中的營養價值進行評估極不便利。因此，面對高粱在飼料中大量應用的現狀，急需建立針對高粱營養成分進行近紅外檢測的方法。本研究將基于近紅外光譜掃描技術探索建立高粱粗脂肪、粗纖維、粗灰分快速檢測模型，以便實現飼料加工企業在高粱采購和應用過程中對粗脂肪、粗纖維、粗灰分指標的快速評估，更好的服務于飼料加工企業。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采集來自于國內不同地區及美國、巴西等不同來源的高粱樣品110份。使用旋風磨(Retsch ZM200型，德國) 粉碎，過1.0 mm標準篩。粉碎后每個樣品采用四分法分為2個重復，裝入自封袋中，干燥避光處存放，并盡快對粉碎的樣品進行近紅外光譜掃描, 同時利用濕化學方法測定粗脂肪、粗纖維、粗灰分含量。

1. 2 濕化學分析

粗脂肪、粗纖維、粗灰分分別采用GB/T 6433—2006、SN/T 0800.8—1999、GB/T 6438—2007測定。

1.3 近紅外光譜掃描

利用本實驗室設備Bruker Tang-R型(德國)近紅外光譜儀采集樣品的近紅外漫反射光譜。為了盡可能在寬的譜區來掃描收集樣品的近紅外光譜，本實驗光譜掃描范圍設置為4 000～12 800 cm-1，分辨率16 cm-1，掃描64次獲得平均光譜。樣品重復裝樣掃描4次，取4次掃描光譜作為樣本的原始光譜。

1.4 NIRS模型的建立與驗證

定標集和驗證集樣品劃分:將樣品按7∶3的比例隨機分為定標集和驗證集，其中驗證集樣品化學值均在定標集樣品化學值的范圍內。

定標模型評價指標:根據相對分析誤差(RPD)值對模型進行評價。當RPD≥3，說明定標效果良好，建立的定標模型可以用于實際檢測，如果2.5≤RPD<3.0，說明利用近紅外光譜掃描對該成分進行定量分析是可行的。如果RPD< 2.5，則說明該成分不適合進行NIRS定量分析[17-19]。

交互驗證集相對分析誤差(RPDCV)計算公式為: RPDCV=樣品集標準差/定標集標準偏差；

驗證集相對分析誤差(RPDV)計算公式為：RPDV=樣品集標準差/驗證集標準誤差。

2 結果與分析

2.1 高粱中粗脂肪、粗纖維、粗灰分的含量測定

高粱中粗脂肪、粗纖維、粗灰分含量測定結果見表1。為了降低濕化學測定誤差，同時也為了保證近紅外分析的準確性，110份樣品的粗蛋白、水分分別由同一實驗員進行操作，并保證檢測時實驗室環境溫度的穩定性和儀器設備校準方法的一致性等。

表1 高粱中粗脂肪、粗纖維及粗灰分含量的測定結果

2.2 高粱樣品近紅外反射光譜及光譜預處理

高粱樣品近紅外掃描原始光譜圖見圖1。粗脂肪、粗纖維、粗灰分光譜預處理參數見表2，預處理模型分別為二階導數、一階導數+多元散射校正與二階導數。優化的預處理方法按照定標集交互驗證標準誤差(RMSECV)的大小排序，RMSECV數值越小越好，選擇RMSECV最小數值的模型作為最優的預處理模型。

圖1 高粱樣品近紅外反射光譜圖

表2 粗脂肪、粗纖維、粗灰分指標的光譜優化預處理結果

指標外部驗證標準誤差光譜范圍/cm-1預處理模型粗脂肪0.3257 500.3～5 443.6二階導數粗纖維0.3124 603～4 243.9一階導數+多元散射校正粗灰分0.1097 500.3～5 443.6二階導數

2.3 近紅外光譜模型的確立和驗證

經過OPUS定量方法建立了高粱中粗脂肪、粗纖維、粗灰分的近紅外光譜檢測定標模型。定標參數及驗證結果如表3。粗脂肪含量預測模型交互驗證相對分析誤差(RPDCV)為3.93，大于評估值3.0；外部驗證相對標準差(RPDV)值為2.57，大于評估值2.5，說明所建立的模型可用于日常監測。粗灰分含量預測模型交互驗證相對分析誤差(RPDCV)為2.37，小于評估值3.0；外部驗證相對標準差(RPDV)值分別為2.34，小于評估值2.5；模型相對分析誤差(RPD)與評估值相對接近，說明模型存在完善的可能性。粗纖維預測模型交互驗證相對分析誤差(RPDCV)和外部驗證相對標準差(RPDV)值分別為1.47、1.23，與評估值差距較大，模型進一步完善的可能性較低。

表3 高粱中粗脂肪、粗纖維、粗灰分模型的定標和交互驗證效果

3 討論

近紅外光譜掃描技術應用于飼料原料中的粗脂肪、粗纖維及灰分的檢測在玉米、豆粕、DDGS等原料中已有報道。因原料、建立的方法、檢測評估的效果不同，導致一些方法評估效果很好，而一些效果不理想，并不適合于日常的檢測應用。李軍濤[14]利用近紅外反射光譜快速評定了玉米營養價值。玉米中酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、淀粉的定標決定系數為0.86～0.95，交互驗證決定系數為0.83～0.93，RPDCV為2.58～3.67，取得了理想的定標效果。而粗灰分的定標效果不理想。粗脂肪、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維的定標決定系數和相對分析誤差分別為分別為0.85～0.91和2.67～3.20，其定標方程具有良好的預測性能，可用于日常檢測，但粗灰分、淀粉的外部驗證結果不理想，暫不能用于日常分析。王燕妮等[20]研究了以玉米、豆粕和棉粕等8 種飼料原料樣品其粗蛋白、粗脂肪、粗纖維的獨立定量模型和針對所有樣品的通用近紅外光譜定量分析模型。玉米和雜粕中粗纖維、粗脂肪及粗蛋白的近紅外檢測模型中驗證集均方根誤差分別為2.027、2.193、12.509、4.941和12.509、4.941，表明粗蛋白的預測結果最好，粗纖維和粗脂肪的預測結果也可以滿足分析要求。沈廣輝等[21]報道了基于在線近紅外光譜快速檢測玉米籽粒主要品質參數的研究，表明粗蛋白在線近紅外定量分析模型效果較好；粗灰分的定量模型效果較差，需要進一步優化。熊利華[22]研究了近紅外光譜法快速檢測茶葉中粗纖維、水分和灰分的方法。粗纖維校正集、驗證集相關系數分別為0.954 3、0.962 3，相對分析誤差分別為3.49，3.56；粗灰分校正集、驗證集相關系數分別為0.981 5、0.983 8，相對分析誤差分別為3.49、3.17，相對分析誤差均大于3，模型預測精度較高。

近紅外光譜技術應用于飼料檢測中，Williams等[18]指出當RPD≥3.0時，模型可用于農產品的質量分析。Chen等[17]指出，當RPDV≥3.0時，定標模型能精確預測相關成分含量；當2.0≤RPDV≤3.0時，定標模型的預測效果可用于大量樣品的篩選工作；當RPD<2.0時，定標模型的預測效果不理想。本研究中粗脂肪含量預測模型RPDCV值為3.93，大于評估值3.0；RPDV值為2.57，大于評估值2.5，說明所建立的模型可用于日常監測。粗纖維、粗灰分含量預測模型RPDCV分別為1.47、2.37，小于評估值3.0；RPDV值分別為1.23、2.34，小于評估值2.5，說明建模效果不理想。

影響近紅外光譜分析結果準確的因素，主要包括儀器和樣品方面。測定儀器的穩定性會引起測定的誤差，如儀器的噪聲、基線的飄逸、標準物校正的準確性、波長的準確性等。樣品方面主要有定標樣品分布、來源、數量、物理性狀及化學分析值的準確性和范圍。樣品物理性狀包括粒度、水分含量、顏色及雜質含量。如水分對近紅外分析結果產生影響主要表現為樣品的水分含量顯著地影響粉碎后顆粒度的大小、形狀及其分布，導致樣品光譜散射系數S發生變化，從而影響其預測結果；通過與其他成分的水合作用，導致某成分最佳波長點發生漂移[23]。定標集樣品應該在非常廣的區域內進行選擇，一定要有代表性, 也就是說定標樣品從待測組分含量，樣品水分含量到樣品來源等都要代表待測集這個大的群體。化學數值測定方面的誤差要盡可能地小，且樣品化學值的數值范圍要寬。本實驗中共采集110份樣品，國外包括美國、巴西，國內樣品在云南、四川、寧夏等地都有收集。在實驗過程中儀器方面嚴格按照操作流程進行操作，樣品測試前進行準確的校正，并保證實驗室內溫度的穩定。在樣品光譜掃描前的粉碎和掃描過程中，以及不同化學指標的測定過程中均由同一人進行操作，盡最大可能減少誤差的產生。研究結果表明粗纖維的定標模型RPD值大于評估值，可以用于檢測，但在實際應用中還需要對測定的樣品進行數據的分析，以實現更加精確的檢測；粗纖維和粗灰分效果不理想，原因可能與粗纖維和粗灰分的組成成分相關外，還在于樣品的代表性方面以及濕化學值范圍不寬有關。因此，下一步需要繼續采集樣品以進一步完善模型。

4 結論

高粱籽實中粗脂肪、粗纖維、粗灰分的近紅外掃描光譜交互驗證集RPD值分別為3.93、1.47與2.37；外部驗證集RPD分別為2.57、1.23與2.34。粗脂肪預測模型交互驗證相對分析誤差大于評估值3.0；外部驗證相對標準差大于評估值2.5，其預測模型可用于實際的應用；而粗纖維和粗灰分的RPD值分別小于評估值，模型需要進一步完善。