甲基紅褪色光度法測定大米中過氧化氫酶活性

董 娜 張愛菊 張小林

(甘肅醫學院，平涼 744000)

植物果實在逆境或衰老時，由于體內活性氧代謝加強而使過氧化氫(H2O2)發生累積，H2O2可進一步生成羥自由基，可直接氧化核酸蛋白質等大分子物質，破壞細胞膜，加速細胞的衰老和解體。過氧化氫酶(CAT)是最重要的酶促防御系統，可清除H2O2，保護細胞正常生活，其活性與植物抗逆性密切相關。

大米在儲藏過程中的新鮮度有很多評價指標[1]，過氧化氫酶活性是其中之一[2]，其常見的檢測方法為國家標準中的碘量法和高錳酸鉀滴定法[3-5]，即通過滴定CAT催化H2O2反應后剩余的H2O2與碘化物作用生成碘量的變化或消耗高錳酸鉀的量計算CAT活性。滴定法優點是所用設備簡單，缺點是測定中憑肉眼觀測滴定終點，存在較大的人為判斷誤差，以及操作中滴定液流量的控制誤差等。除此之外，其他領域還有多種方法報道，包括紫外光度法[6-8]、熒光分析法[9]、化學動力學光度法[10-14]等。董娜等[14]以二苯胺磺酸鈉為底物完成CAT顯色動力光度法測定，但顯色靈敏度有限，H2O2表觀摩爾吸光系數ε<5.0×102L/(mol·cm)。

甲基紅是一種偶氮基有色染料，摩爾吸光系數ε=5.0×102L/(mol·cm)，遇氧化劑氧化降解而褪色，褪色程度與氧化劑的量有確定的函數關系[15]，在硫酸介質中能被過氧化氫氧化為無色，Fe3+可以加速氧化反應進程，通過CAT加入前后吸光度變化值實現酶活性測定。

目前過氧化氫酶活性單位表述不統一，多采用μmol/(min·mL)[16]，酶活性定義為：1個單位的過氧化氫酶是指在pH為7.0、25 ℃下每分鐘能分解1 μmol的H2O2。國家標準規定酶活性的單位是mg/g[1]，即以每克組織樣品中過氧化氫酶含量的多少來表示其活力的大小。該法具有相對的權威性，但沒有對酶液做出特別說明。實驗證實，酶催化反應速度完全取決于底物中酶量多少。本實驗采用μmol/L(U/L)表示酶液酶活性，采用μmol/g(U/g)表示固體組織樣品中酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧夏長粒香米、寧夏普通大米、東北長粒香米、東北普通大米：均為2017年、2018年產。

CAT標準品：配制濃度1 mg/mL(5 000 U/mL)，高錳酸鉀標定后配成1 U/mL；0.1 g/L甲基紅(乙醇溶解，含0.6 g/L EDTA)；0.01 mol/L Fe3+溶液：稱取5 g硫酸鐵銨于50 mL燒杯中，加入0.02 mol/L的H2SO4溶液20 mL，待溶解后移入100 mL容量瓶中，用水稀釋至100 mL，搖勻；5×10-4mol/L甲基紅乙醇溶液(含φ=95 %的乙醇)；2 mmol/L H2O2基質液；2 mol/L H2SO4溶液；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)；實驗用水為二次蒸餾水，試劑均為分析純。

7230G型可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 過氧化氫酶活性的測定

1.2.1.1 甲基紅褪色光度法

向50 mL容量瓶中加入35 ℃預熱5 min后的CAT樣液(酶活小于1 000 U/mL)1.00 mL、H2O2基質液4.00 mL，混合反應20 min后立即加入2.5 mL硫酸終止反應。然后依次加入甲基紅5.00 mL，Fe3+溶液2.5 mL，搖勻，40 ℃水浴60 min后加水定容，用1 cm比色皿，以蒸餾水為參比，于510 nm處測定吸光度A。同時完成酶空白實驗吸光度A0測定，根據ΔA(ΔA=A0-A)確定過氧化氫酶活性E。

1.2.1.2 高錳酸鉀法和碘量法

對寧夏長粒香米用高錳酸鉀法和碘量法進行測定[3]，實驗平行測定6次，計算原樣品酶含量(U/g)，并與甲基紅褪色光度法作比較。

1.2.2 大米樣品測定

分別稱取3.00 g(已扣除水分)過篩后的8種大米粉，加入50.00 mL、pH=7.0生理鹽水，研磨振蕩混合后定容至1 000 mL，過濾，取濾液2.00 mL，測定過氧化氫酶活性，實驗平行6次，并測定回收率。

2 結果與分析

2.1 吸收光譜與最大吸收波長

不同體系吸收光譜見圖1所示。空白體系(不含H2O2和CAT)在510 nm處有最大吸收，峰形尖銳，峰值較高，甲基紅(MR)摩爾吸光系數ε=2.52×104L/(mol·cm)；非酶體系(不含CAT)保持原有峰形，這說明H2O2與MR僅存在單純的褪色反應；加入CAT后，褪色程度受抑制(酶促體系)，峰位未發生改變，這說明引起褪色反應的核心物質是過氧化氫，在過氧化氫取值一定時，褪色程度與過氧化氫酶活度有一定的函數關系。實驗選取510 nm作測定波長。

圖1 吸收光譜圖(E=0.1 U/mL)

2.2 褪色反應催化劑選擇

設定H2O2的濃度為0.16 mmol/L，針對非酶體系實驗考察不同金屬離子催化性能。結果表明：Fe3+、Fe2+和Mn2+對H2O2氧化甲基紅褪色反應均有催化作用，但性能有差異。Fe2+酸性環境下更易被H2O2氧化，阻抑和催化并存，Mn2+優于Fe2+；相對而言Fe3+作用更為顯著，Fe3+依托其特有的中強度氧化性，在H2O2和甲基紅之間構建一條電子通道。因此選擇Fe3+作催化劑。

2.3 甲基紅用量考察

甲基紅溶液的顏色和吸光度值取決于溶液酸度和甲基紅用量，控制pH≤2，測定甲基紅溶液吸光度A，在V=0.00～7.00 mL范圍內，A與V有很好的線性關系。為了減少測量誤差，將測量體系吸光度控制在0.200～0.700范圍內，實驗確定甲基紅用量為5.00 mL。

2.4 底物H2O2用量設置

僅針對酶空白體系，改變H2O2的量，使反應液中H2O2分別為0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mmol/L，按實驗方法完成褪色反應。由圖2可知：當H2O2的濃度在0.00～0.20 mmol/L時，H2O2的用量與吸光度呈線性關系，當H2O2的濃度達到0.24 mmol/L時，甲基紅完全被降解，吸光度趨于0，因此，選擇H2O2濃度為0.16 mmol/L，即2 mmol/L H2O2體積設定量為4.00 mL。

圖2 底物H2O2用量

2.5 褪色反應溫度及時間

分別在25、30、35、40、45、50、60 ℃條件下完成褪色反應。室溫下，褪色反應緩慢；40 ℃時反應60 min，線性關系最好。

2.6 硫酸用量

酶促反應的終結和氧化褪色反應均需要硫酸，硫酸介質又能有效克服Fe3+溶液水解，確保甲基紅溶液顏色恒定；避免酶液加入后出現二次渾濁。取酶標準液6.00 mL，其他條件不變，僅改變硫酸用量，測定吸光度和溶液pH。當V<2 mL時，pH=0.9，ΔA有最大值。實驗選用硫酸體積2 mL。

2.7 酶促反應時間影響

在底物濃度為0.16 mmol/L、30 ℃條件下，加入酶標準液3.00 mL和6.00 mL，分別反應1、2、3、4、5、6、7、8、9 min，作出酶促反應曲線。由圖3可知：兩條曲線變化趨勢完全一致，在反應0～3 min和5～20 min內，酶促反應速率與時間成正比，單位時間內ΔA變化一致，符合酶促催化一級反應特征。20 min后，A值趨于穩定。因此，確定酶促反應時間為20 min。

圖3 反應時間與反應速率的關系

2.8 工作曲線

取過氧化氫酶標準溶液0.00～1.00 mL作測試液，在最佳條件下完成ΔA測定，繪制工作曲線(圖4)。過氧化氫酶活力E在0～0.12 U/mL范圍內與ΔA呈良好的線性關系：ΔA=0.001+2.276E，r=0.998 9，按實驗方法平行測定空白10次，標準偏差s為0.005，3倍的信噪比求得檢測限為0.007 U/mL。

圖4 工作曲線

2.9 干擾實驗

取0.50 mL作測試液過氧化氫酶標準溶液作測試液，按照試驗方法考察生物組織共存還原性物質干擾情況。結果發現，濃度小于基底液1/2濃度的葡萄糖、果糖、維生素C、乳糖、半乳糖不影響ΔA測定，測量誤差小于1%。

2.10 大米樣品分析

大米樣品分析及回收率實驗結果見表1。

由表1可見2018年份的大米優于2017年份，其中，2018年份的成品寧夏長粒香米、寧夏普通大米、東北長粒香米、東北長粒大米酶含量依次為213.58、195.83、112.66、91.50 U/g。酶含量越多，保鮮度越高，因此，2018年份的長粒香米具有更高的性價比。該方法精密度檢驗RSD=2.09%～4.57%，加標回收率在96.01%～102.40%范圍內，說明粗酶液共存物質不影響酶活性測定。

用高錳酸鉀法和碘量法對寧夏長粒香米進行測定，并與甲基紅褪色光度法作比較，結果見表2。

表1 樣品分析及回收率實驗結果(n=6)

注：加標物來自購置品，經本法測得CAT活性后，作為已知活性的添加物。

表2 3種過氧化氫酶的測定方法比較 (n=6)

甲基紅褪色光度法、高錳酸鉀法和碘量法的標準偏差S分別為1.63、1.91和2.37，甲基紅褪色光度法與高錳酸鉀法合并標準偏差SR為1.78，t=1.49，查表得t0.05,10=2.228，即t

3 結論

過氧化氫與甲基紅能夠發生褪色反應，褪色程度與酶活性有函數關系。在最佳條件下，最大吸收波長510 nm，甲基紅用量5 mL，過氧化氫用量4 mL，硫酸用量2 mL，褪色反應溫度及時間為40 ℃、60 min，CAT活性E與ΔA呈良好的線性關系：ΔA=0.001+2.276E(U/mL)。該方法可簡單、快速測定不同產地、不同年份大米的過氧化氫酶活性。