隴南油橄欖“皮瓜爾”果實活性成分的動態變化

馬君義 后春靜 呂孝飛 楊立華 鄧 煜 孔維寶 閆輝強

(西北師范大學生命科學學院1，蘭州 730070) (甘肅特色植物有效成分制品工程技術研究中心2，蘭州 730070) (隴南市經濟林研究院油橄欖研究所3，武都 746000)

油橄欖(OleaeuropaeaL．)屬于木犀科木犀欖屬常綠闊葉喬木，又名洋橄欖、齊墩果，栽培歷史悠久，與油茶、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物，有高產、優質、高效益等特點，是人類最早馴化并且栽培的果樹之一[1]。橄欖油是新鮮的油橄欖果實通過機械加工(壓榨離心)提取得到，不需要加熱、溶劑或任何預處理，是世界上唯一以自然形態存在的食用植物油[2]。橄欖油中含有多酚、黃酮、維生素、角鯊烯以及不飽和脂肪酸等，具有調節膽固醇、抗氧化、預防癌癥、美容及調整人體生理機能的作用，享有“液體黃金”“植物油皇后”等美譽。

隨著生活水平的提高以及人們對健康的重視，橄欖油越來越受到世界各國消費者的喜愛[3]。橄欖油的成分及品質主要取決于油橄欖果實，而栽培品種、收獲時間以及生物和非生物脅迫等生長條件是影響油橄欖果實品質的主要因素[4]。在生長發育的過程中，油橄欖果實會發生諸如質量、果肉/果核比、顏色、油脂積累、酶活性以及化學成分等許多變化，這些變化會影響橄欖油的化學成分、感官特征和果實的硬度[5]。因此，根據不同品種的成熟期，選擇各自的最佳采收期，避免集中收獲顯得尤為重要[6,7]。本實驗以甘肅隴南種植的油橄欖“皮瓜爾”果實為研究對象，對油橄欖果實生長發育過程中表型性狀和活性成分的動態變化進行了系統分析，以期為我國油橄欖果實的品質形成及良種選育研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

以油橄欖品種“皮瓜爾”(Picual)的果實為實驗材料，于每月(2017年8月10日至2018年3月30日)10、20、30號在橄欖樹的上下前后左右6個方位采摘20顆果實。采樣地點為甘肅省隴南市經濟林研究院油橄欖研究所種質資源基因庫(海拔1 036～1 048 m；東經104°53′30″、北緯33°24′03″；平均氣溫15.3 ℃，最高氣溫38.2 ℃、最低氣溫-7 ℃；相對濕度56.6%，降水量468 mm，主要降水集中于6月份至9月份；日照時數1871 h；土質為沙壤土，pH 7.9。)

1.2 儀器與設備

Trace 1300 ISQ型氣相色譜-質譜聯用儀、UV 8100B型紫外-可見分光光度計、IKA A11基本型研磨粉碎機、M6小精靈迷你離心機、 SZF-06C型粗脂肪測定儀、KH7200DB型數控超聲波清洗器。

1.3 試劑與藥品

石油醚(30～60 ℃)、無水乙醇、甲醇、碳酸鈉、福林酚、三氯化鋁、無水硫酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純；沒食子酸對照品(純度99.9%)、蘆丁對照品(純度≥98%)、10種脂肪酸甲酯混標(C16～C22)，實驗用水為去離子水。

1.4 方法

1.4.1 油橄欖果實表型性狀的測定

果實采摘后12 h內對鮮果質量、縱徑、橫徑進行測定，果形指數=縱徑/橫徑[8]。

將油橄欖果實清洗干凈后，放入50 ℃烘箱內干燥至恒重，稱其干果質量，根據鮮果重和干果重計算含水率。

1.4.2 油脂的提取

取50 ℃條件下干燥至恒重的油橄欖果實適量，研磨粉碎，精密稱取約1.000 g粉末用濾紙包好后放入粗脂肪測定儀的抽提瓶中，加入50 mL石油醚，回流提取3 h，3組平行實驗。

1.4.3 含油率的測定

將回流后的抽提瓶放入45 ℃烘箱內以除去微量的石油醚和水分，待抽提瓶冷卻后稱重，根據油脂的質量和油橄欖粉末的質量計算含油率。

式中：m為油橄欖粉末的質量；m1為抽提瓶質量；m2為油和抽提瓶質量。

1.4.4 多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu顯色法[9]，稍有改動。精密稱取油橄欖果實粉末約1.000 g，用石油醚除去油脂和色素，加10 mL 70%乙醇于超聲波清洗器中超聲輔助提取(時間30 min、溫度45 ℃、頻率28 kHz)，重復提取3次，合并提取液、過濾、旋轉蒸發、定容到10 mL容量瓶中。稀釋并取待測液0.25 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，8 min內加入2 mL 10%的Na2CO3溶液，最后用去離子水定容至10 mL，在30 ℃下避光反應2 h，于765 nm處測量吸光度。依回歸方程y= 7.374 1x- 0.005(R=0.999 3)計算多酚含量。

1.4.5 黃酮含量的測定

采用三氯化鋁顯色法[10]，稍有改動。精密稱取油橄欖果實粉末約1.000 g，用石油醚除去油脂和色素，加10 mL 70%的乙醇于超聲波清洗器中超聲輔助提取(時間30 min、溫度45 ℃、頻率28 kHz)，重復提取3次，合并提取液、過濾、旋轉蒸發、定容至10 mL容量瓶中。吸取3.0 mL待測液于10 mL容量瓶中，加4 mL 0.1 mol/L三氯化鋁甲醇溶液，充分搖勻，5 min后用甲醇定容至10 mL，于410 nm處測定吸光度。依回歸方程y= 31.096 7x- 0.341 4(R=0.999 2)計算黃酮含量。

1.4.6 油脂中脂肪酸組成與含量的分析

脂肪酸的甲酯化：采用酯交換法[11]。精密稱取油樣約0.300 g于20 mL具塞試管中，加5 mL氫氧化鈉-甲醇溶液(0.5 mol/L)搖勻，在常溫(25 ℃水浴)下反應40 min，每5 min振搖1次，取出后加入5 mL的石油醚，搖勻，靜置，最后加入5 mL的去離子水，使所有的有機相到試管頂部，用移液槍吸取上層有機相于離心管中，加無水硫酸鈉干燥，離心，過濾，稀釋，進樣。

GC條件：AE-FFAP彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm)；載氣為99.999 9%的高純氦氣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為160 ℃保持3 min，以4 ℃/min的速率升至190 ℃保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至210 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min的速率升至240 ℃，保持5 min；進樣量1 μL；進樣方式為分流進樣，分流比50∶1；載氣模式為恒流模式；載氣流速1.0 mL/min；GC-MS接口溫度250 ℃。

MS條件：離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電離方式EI；電離電壓70 eV；質量掃描范圍50～650 amu；質量掃描方式為Full Scan；溶劑延遲3 min；質譜數據庫：NIST 2011版質譜數據庫。

脂肪酸的定性與定量：采用NIST 2011版質譜數據庫檢索并結合C16～C22脂肪酸甲酯混標比對分析定性。采用峰面積歸一化法計算果實油脂中主要脂肪酸的相對含量。

1.5 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 “皮瓜爾”果實表型性狀隨生長發育的動態變化

“皮瓜爾”果實呈卵圓形，果頂微具乳突，不對稱，果點明顯，大而凹陷；果核橢圓形，稍長，頂尖基部圓形，表面粗糙。11月10日之前，“皮瓜爾”果皮呈現綠色，之后逐漸轉為部分紅色、紫紅色，至12月20日果皮全部變為紫紅色、紫黑色。

圖1為“皮瓜爾”果實表型性狀隨生長發育的動態變化。由圖1a可知：含水率在生長發育過程中呈現先下降后上升的變化趨勢，其變化范圍為39.72%～63.17%。由圖1b可知：鮮果單重在10月20日之前逐漸增大，之后呈波浪式增大，其變化范圍為1.18～

圖1 “皮瓜爾”果實表型性狀隨生長發育的變化

2.81 g；干果單重整體呈現上升趨勢，其變化范圍為0.45～1.36 g。由圖1c可知：果形指數在10月20日之前下降，之后上升，次年1月10日之后又開始下降，其變化范圍為1.29～1.50。該實驗結果與孔維寶等[12]的研究結果基本一致。

2.2 “皮瓜爾”果實含油率隨生長發育的動態變化

“皮瓜爾”果實含油率隨生長發育的動態變化如圖2所示。由圖2可知，在“皮瓜爾”果實生長發育過程中，其含油率整體呈現上升趨勢，從8月10日的3.89%迅速增長到10月20日的38.62%，而后以緩慢的速度上升，到12月30日含油率達到最高43.20%。Beltrán等[13]在研究油橄欖果實成熟過程中油脂積累的季節性變化時發現，Picual、Hojiblanca、Frantoio 3個品種有不一樣的成熟模式，Picual油脂積累最快，而Hojiblanca是成熟最晚的品種。11月中旬之后果實生長速度和油脂累積速率開始減慢，在此期間采收能得到更高的產油率和更好的品質，并避免了果實的自然脫落。

圖2 “皮瓜爾”果實含油率隨生長發育的變化

利用SPSS軟件對“皮瓜爾”果實含油率隨生長發育的動態變化進行擬合分析，含油率與采摘時間呈三次曲線關系，其擬合方程為y=-3.905+7.112x- 0.368x2+0.006x3，R2=0.932。10月20日之前以較快的速度上升，之后稍有下降。Jia-wei Wang等[14]研究了種植于武都地區的8個不同品種油橄欖的含油率，有關“皮瓜爾”果實最高含油率與本實驗結果接近，但最高含油率出現的時間晚于文獻報道。Dag等[15]研究發現在Barnea的整個成熟期隨著時間的推移油脂不斷累積，含油率逐漸增加并保持較高品質。Cecchi等[16]研究表明，油脂累積的同時伴隨著還原糖的大量消耗。

2.3 “皮瓜爾”果實多酚、黃酮含量隨生長發育的動態變化

圖3為“皮瓜爾”果實多酚、黃酮含量隨生長發育的動態變化。由圖3可知，“皮瓜爾”果實中多酚含量高于黃酮含量，且多酚、黃酮含量整體呈現先下降后上升的趨勢。多酚含量在10月30日最低(2.64 mg/g)，次年3月30日最高(6.93 mg/g)，10月30日至次年1月10日之間多酚含量較低。黃酮含量在11月10日最低(0.59 mg/g)，9月10日含量最高(1.75 mg/g)。

圖3 “皮瓜爾”果實多酚、黃酮含量隨生長發育的變化

對“皮瓜爾”果實多酚、黃酮含量隨生長發育的動態變化關系進行擬合分析，11種擬合方式中，三次曲線的擬合度最高，多酚的擬合方程為y= 8.023-1.146x+0.081x2+0.001x3，R2=0.836。黃酮的擬合方程為y= 1.894-0.132x+0.004x2-0.000 1x3，R2=0.515。黃酮含量在11月10日之前呈下降趨勢，之后開始上升。多酚含量在10月30日之前是下降趨勢，之后開始上升，該結果與Morelló等[17]研究得到多酚含量的變化趨勢是先下降后趨于平穩的結果存在差異，產生這種差異的原因可能是由于本研究延長了樣品的采摘時間所致。Menz等[18]研究顯示，總多酚在成熟前期急劇下降，而在成熟后期稍有上升，這一變化趨勢與本研究12月30日之前采摘分析的研究結果相吻合。

圖4 “皮瓜爾”脂肪酸GC-MS總離子流色譜疊加圖

2.4 “皮瓜爾”果實油脂脂肪酸組成和相對含量隨生長發育的動態變化

圖4為“皮瓜爾”橄欖油中脂肪酸經過GC-MS分析，依據色譜峰保留時間和峰面積將共有峰進行疊加，得到各采摘期的總離子流色譜圖。由圖4可知，在生長發育過程中脂肪酸含量在不同采摘時間存在差異，但種類保持不變。

“皮瓜爾”橄欖油中脂肪酸含量由高到低依次為油酸(C18∶1)、棕櫚酸(C16∶0)、亞油酸(C18∶2)、硬脂酸(C18∶0)、亞麻酸(C18∶3)、棕櫚油酸(C16∶1)、花生酸(C20∶0)、花生烯酸(C20∶1)、山俞酸(C22∶0)、十七烯酸(C17∶1)、十七酸(C17∶0)。油酸呈現先上升后下降的趨勢，11月30日含量最高(75.35%)，次年3月30日含量最低(64.03%)。棕櫚酸整體呈現下降趨勢，9月20日含量最高(17.34%)，次年2月28日含量最低(11.53%)。亞油酸含量呈現先下降后上升的趨勢，次年3月30日達到最高(9.49%)，12月10日含量最低(3.76%)。其他脂肪酸含量變化幅度相對較小。

圖5 “皮瓜爾”橄欖油中主要脂肪酸含量隨生長發育的變化

“皮瓜爾”橄欖油中主要脂肪酸含量隨生長發育的變化如圖5所示。由圖5a可知，UFA和SFA呈現相反的變化趨勢，UFA呈先上升后下降的趨勢，而SFA呈先下降后上升的趨勢，在11月30日含量分別達到最高值(82.01%±0.07%)和最低值(17.10%±0.05%)；MUFA和PUFA也呈現相反的變化趨勢，MUFA是先上升后下降，而PUFA是先下降后上升，MUFA在11月30日含量達到最大值(76.38%±0.10%)，PUFA在12月10日含量降到最低值(4.40%±0.04%)；由圖5b可知，C18∶1/C18∶2和MUFA/PUFA變化趨勢一致，呈先上升后下降的變化趨勢，12月10日比值達到最大，分別為19.70和17.02。Gómez等[19]研究了種植于西班牙地區的“皮瓜爾”脂肪酸含量在成熟過程中的變化，本實驗結果MUFA和SFA的變化范圍與Gómez實驗結果一致，但PUFA的最低含量高于文獻報道。

2.5 “皮瓜爾”果實油脂脂肪酸主成分分析

利用SPSS軟件進行主成分分析，評價“皮瓜爾”果實油脂中主要脂肪酸的相對含量變化，得到主成分個數及累積方差貢獻率如表1所示。由表1可知，第1主成分的方差貢獻率為39.634%，第2主成分的方差貢獻率為28.102%，第3主成分的方差貢獻率為15.520%，前3個主成分的累積方差貢獻率達到83.256%。

表1 成分特征值和貢獻率

圖6為主成分分析載荷圖。由圖6可知，位于第1主成分上的脂肪酸有棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸、十七烯酸、十七酸、山俞酸、花生烯酸，位于第2主成分上的脂肪酸有油酸、亞油酸、花生酸，位于第3主成分上的脂肪酸有棕櫚油酸。

圖6 脂肪酸主成分分析載荷圖

根據主成分的特征值和特征向量，計算主成分得分，依據每個采摘時間的3個主成分得分計算綜合得分并排序，綜合主成分分值越高，性狀越好。取24個得分中排名前10的主成分得分，結果如表2所示。由表2可知，8月10日至10月20日及11月30日的綜合得分排名靠前，說明在該時間段內“皮瓜爾”果實中油脂品質處于較佳狀態。

表2 脂肪酸主成分得分

2.6 氣象因子與各測定指標的相關性分析

2017年8月10日—2018年3月30日“皮瓜爾”生境氣象因子變化如圖7所示。由圖7可知，旬均溫度的變化趨勢是先下降后上升；旬均相對濕度的變化趨勢是先上升后下降；旬均日照時長在10月30日之前是下降的狀態；在11月10日至次年1月10日旬均降水量為零。

“皮瓜爾”果實表型性狀、主要活性成分與氣象因子的相關性分析如表3所示。由表3可知，干果單重與旬均溫度呈極顯著負相關，與旬均相對濕度、旬均降水量呈顯著負相關；含水率與旬均溫度、旬均相對濕度呈極顯著正相關；含油率與旬均溫度呈極顯著負相關，與旬均相對濕度、旬均降水量呈顯著負相關；黃酮含量與旬均溫度呈極顯著正相關；PUFA與旬均溫度、旬均降水量呈極顯著正相關，與旬均日照時長呈顯著正相關； C18∶1/C18∶2與旬均溫度呈顯著負相關，而MUFA/PUFA與旬均溫度呈極顯著負相關。

圖7 油橄欖生境氣象條件

表3 各表型性狀及主要活性成分與氣象因子的相關系數

指標旬均溫度/ ℃旬均相對濕度/%旬均降水量/mm旬均日照時長/h干果單重/g-0.837??-0.515?-0.543?-0.021含水率/%0.877??0.618??0.275-0.036含油率/%-0.842??-0.509?-0.590?0.033多酚/mg/g0.231-0.2850.1760.393黃酮/mg/g0.547??0.1740.2380.098UFA/%0.1610.1970.262-0.119SFA/%0.3720.286-0.029-0.084MUFA/%-0.3370.091-0.358-0.358PUFA/%0.609??0.0340.680??0.409?C18∶1/C18∶2-0.429?0.064-0.389-0.401MUFA/PUFA-0.582??-0.092-0.489-0.316

注：*表示在0.05水平上顯著相關；**表示在0.01水平上極顯著相關。

“皮瓜爾”果實表型性狀與主要活性成分的相關性分析如表4所示。由表4可知，含油率與干果單重呈極顯著正相關，而與含水率呈極顯著負相關，與果形指數呈顯著負相關；黃酮含量與干果單重呈極顯著負相關，與含水率呈顯著正相關；UFA與干果單重呈顯著負相關；PUFA與干果單重呈極顯著負相關，與含水率呈顯著正相關。MUFA/PUFA與干果單重呈顯著正相關，而與含水率呈顯著負相關。

表4 表型性狀與主要活性成分的相關系數

注：*表示在0.05水平上顯著相關；**表示在0.01水平上極顯著相關。

3 結論

研究了“皮瓜爾”果實的表型性狀、含油率、多酚和黃酮含量以及油脂中脂肪酸組成與含量在生長發育過程中的動態變化規律，探討了氣象因子與各測定指標的相關性。結果表明：

“皮瓜爾”果實表型性狀的變化范圍分別為：鮮果單重1.18～2.81 g，干果單重0.45～1.36 g，含水率39.72%～63.17%，縱徑16.67～20.75 mm，橫徑11.08～14.97 mm，果形指數1.29～1.50。縱橫徑、果實質量在10月20日之前呈上升狀態，之后鮮果單重與干果單重的變化趨勢稍有不同。果形指數相對穩定，但變化幅度不大。含水率在整個生長季呈先下降后上升的趨勢。

“皮瓜爾”果實含油率8月10日最低，為3.89%，12月30日最高，達43.20%。10月20日之前含油率以較快的速度上升，之后稍有下降。多酚含量在10月30日之前呈下降趨勢，之后開始上升。10月30日含量最低，為2.64 mg/g，次年3月30日含量最高，為6.93 mg/g；黃酮含量在11月10日之前呈下降趨勢，之后開始上升。11月10日含量最低，為0.59 mg/g，9月10日含量最高，為1.75 mg/g；多酚和黃酮含量相對較低的時間段為10月30日—11月20日。

“皮瓜爾”果實油脂主要脂肪酸相對含量的變化范圍為：油酸64.03%～75.35%，棕櫚酸11.53%～17.34%，亞油酸3.76%～9.49%，SFA 11.19%～21.81%，MUFA 64.28%～76.38%，PUFA 4.40%～12.56%；MUFA含量、MUFA/PUFA及C18∶1/C18∶2的比值在12月10日之前相對較高。

主成分分析表明，8月10日至10月20日及11月30日時間段內“皮瓜爾”果實中油脂品質處于較佳狀態。從符合中國消費者口味的角度，建議“皮瓜爾”果實的最佳采收期為10月20日—11月30日。

相關性分析表明，“皮瓜爾”果實干果單重與旬均溫度呈極顯著負相關。含油率與旬均溫度、含水率呈極顯著負相關，而與干果單重呈極顯著正相關。多酚含量與旬均溫度、單果單重有相關性但不顯著，而黃酮含量與旬均溫度呈極顯著正相關、與單果單重呈極顯著負相關。PUFA含量與旬均溫度、旬均降水量呈極顯著正相關，而與單果單重呈極顯著負相關。MUFA/PUFA與旬均溫度呈呈極顯著負相關，而與單果單重呈顯著正相關。