表沒食子兒茶素沒食子酸酯對米糠蛋白結構和功能性質的影響

苗向碩 吳 偉 吳曉娟

(中南林業科技大學食品科學與工程學院;稻谷及副產物深加工國家工程實驗室,長沙 410004)

米糠是糙米碾白產生的主要副產物，米糠含有11%～17%的米糠蛋白。米糠蛋白氨基酸比例合理、過敏性低、生物效價和消化率高，是一種優質新型植物蛋白源，可應用于多種食品中，如嬰幼兒食品、烘焙食品、肉制品、飲料、奶、咖啡、糖果等[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是綠茶中已知的最主要的活性酚類物質，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎等生理活性作用[2]。EGCG不僅能提高食品的營養價值，還能減少食品中穩定劑、著色劑和防腐劑的使用，其作為一種優良的食品添加劑在食品工業中的應用前景十分廣闊。在食品的生產加工過程中，EGCG難免會與蛋白接觸，EGCG可以通過疏水相互作用、氫鍵和范德華力等與蛋白形成復合物[3-5]，進而影響蛋白的結構和功能性質。因此近年來蛋白質與EGCG的復合對蛋白結構與功能性質的影響成為研究熱點。付珊琳等[3]研究表明EGCG使去折疊β乳球蛋白的二級和三級結構變化。Al-Hanish 等[6]研究發現 EGCG使α-乳清蛋白的二級結構改變。胡思等[7]研究發現茶多酚的加入顯著降低了面筋蛋白的溶解度和起泡性。劉澤宇等[8]研究發現添加茶多酚能顯著提高草魚魚肉蛋白質的乳化穩定性，并延緩乳化能力的降低。而對于米糠蛋白與EGCG的復合對蛋白結構和功能性質的影響鮮見研究。

由于在高溫和堿性條件下，EGCG很不穩定，容易裂解以及被氧化成不需要的副產物，如醌類化合物[5]。因此，本研究將不同比例的EGCG與米糠蛋白在常溫中性條件下進行反應，研究EGCG對米糠蛋白結構和功能性質的影響，對于EGCG等天然酚類物質在富含米糠蛋白食品生產加工中的應用提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%)、5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、1-苯氨基萘-8-磺酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Sorvall LYNX 6000高速落地離心機；FD5-4冷凍干燥機；F4600 熒光分光光度計；Blue Star紫外可見分光光度計；LC-20 液相色譜儀；IRTracer-100傅里葉紅外光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白提取

參考吳偉等[9]的方法提取米糠蛋白。將脫脂米糠和去離子水以1∶10(g∶mL)混合，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下攪拌提取4 h，隨后以8 000 r/min在4 ℃下離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl調pH至4.0，靜置20 min后在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min得到米糠蛋白沉淀，水洗米糠蛋白沉淀3次后將沉淀分散于5倍體積的去離子水中，用2 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0，冷凍干燥得到純度為92.81%(干基)的米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白總巰基含量的測定

采用DTNB比色法測定米糠蛋白的總巰基含量[5]。將0.25 g米糠蛋白溶于50 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly溶液中，分別加入不同量EGCG(EGCG:米糠蛋白質量比為0∶1，0.05∶1，0.1∶1，0.15∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1，)，攪拌30 min，在25 ℃下靜置反應2 h，10 000 r/min離心15 min，取上清液用考馬斯亮藍比色法測定溶液中蛋白質含量。取4 mL蛋白質溶液加入0.2% β-巰基乙醇處理2 h 后，再加入 8 mL 12%的三氯乙酸沉淀蛋白質1 h，在10 000 r/min離心10 min，用三氯乙酸溶液重復洗滌沉淀3次后，將沉淀溶于6 mL Tris-Gly 緩沖液中，加入240 μL DNTB，在412 nm波長下測定吸光度，以摩爾消光系數13 600 L/(mol·cm)計算總巰基含量。

1.3.3 米糠蛋白傅里葉紅外光譜酰胺Ⅰ帶的測定

將米糠蛋白溶于0.02 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，最終米糠蛋白濃度為1 mg/mL，加入不同量的EGCG(同1.3.2)混合，攪拌30 min，在25 ℃下靜置反應2 h，然后冷凍干燥成粉末。在室溫、干燥環境下，分別將2 mg米糠蛋白和EGCG改性的米糠蛋白樣品與200 mg KBr研磨混合均勻后壓片5 min制成透明薄片，采用傅里葉紅外測定儀進行掃描。掃描波數范圍：400～4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描次數：64。

1.3.4 米糠蛋白表面疏水性的測定

采用1-苯氨基萘-8-磺酸作為熒光探針法測定米糠蛋白的表面疏水性[5]。將0.45 g米糠蛋白溶于30 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，加入不同量EGCG (同1.3.2)，攪拌30 min，在25 ℃下靜置反應2 h，采用考馬斯亮藍比色法測定溶液中蛋白質含量，并將蛋白質溶液稀釋為蛋白濃度在0.005～0.50 mg/mL之間5個不同濃度梯度。取不同蛋白濃度溶液4 mL，分別加入50 μL 8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液，在激發波長390 nm、發射波長470 nm處測定熒光強度。以熒光強度對蛋白質濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為米糠蛋白的表面疏水性指數。

1.3.5 米糠蛋白內源熒光光譜的測定

在10 mL試管中加入2 mL濃度為1.5 mg/mL 米糠蛋白溶液，加入梯度體積的3 mg/mL的EGCG溶液，后加入pH 7.0的0.02 mol/L 的磷酸鹽緩沖液定容至3 mL，最終米糠蛋白濃度為1 mg/mL，得到質量比為0∶1，0.05∶1，0.1∶1，0.15∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1(EGCG∶米糠蛋白)的混合液，攪拌30 min，然后選擇激發波長為290 nm，發射波長為300～500 nm，激發和發射的狹縫寬度分別為5 nm和10 nm ，掃描速度1 200 nm/min的條件下測定熒光光譜。

1.3.6 米糠蛋白相對分子質量分布的測定

將米糠蛋白分散于0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液中(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)，配制成蛋白濃度10 mg/mL的溶液，分別加入不同量的EGCG，使得EGCG濃度分別為0、0.5、1、1.5、2、5、10 mg/mL，此時EGCG與米糠蛋白的質量比分別為0∶1、0.05∶1、0.1∶1、 0.15∶1、 0.2∶1、0.5∶1、1∶1。攪拌30 min，在25 ℃下靜置反應2 h，隨后過孔徑0.45 μm的醋酸纖維素膜，收集濾液。采用LC-20A高效液相色譜儀對樣品進行分析，色譜柱：TSKgel SW G4000 SWXL；檢測器：Waters 996光電二極管陣列檢測器；流動相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)；檢測波長：280 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃。

1.3.7 米糠蛋白凝膠電泳分析

濃縮膠質量分數4%，分離膠質量分數12.5%；電極緩沖液含0.1%十二烷基硫酸鈉(pH 8.3)，0.384 mol/L Gly，0.05 mol/L Tris；樣品溶解液為0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，含2%十二烷基硫酸鈉，10%甘油，0.02%溴酚藍，5% β-巰基乙醇；樣品濃度1.5 mg/mL，上樣量10 μL。電泳采用0.75 mm凝膠板，開始時電流為10 mA，樣品進入分離膠后調為25 mA。

1.3.8 米糠蛋白溶解性的測定

將0.50 g米糠蛋白樣品分散于50 mL去離子水中，加入不同量EGCG(同1.3.2)，攪拌30 min，在25 ℃下靜置反應2 h，室溫條件 10 000 r/min 離心 20 min 收集上清液。隨后采用微量凱氏定氮法測定上清液中可溶解氮含量，蛋白質溶解性表示為可溶解氮與樣品中總氮的百分比。

1.3.9 米糠蛋白持水性的測定

預先稱重離心管的質量m1，準確稱取200 mg米糠蛋白m2，加入不同量EGCG(同1.3.2)m3，加入10 mL去離子水在離心管中混合，用渦流振蕩器混合攪拌均勻。然后在3 000 r/min離心20 min，輕輕倒出上清液避免損失蛋白質，稱總質量m4，米糠蛋白持水性表示為吸收水的質量占樣品的質量的百分比，計算公式如下：

1.3.10 米糠蛋白持油性的測定

預先稱重離心管的質量M1，準確稱取200 mg米糠蛋白M2，加入不同量EGCG(同1.3.2)M3，加入15 mL大豆油在離心管中混合，用渦流振蕩器混合攪拌均勻，3 000 r/min離心20 min，倒出上清液后稱總質量M4。米糠蛋白持油性表示為吸收油的質量占樣品的質量百分比，計算公式如下：

1.3.11 米糠蛋白起泡能力和泡沫穩定性的測定

準確稱取米糠蛋白200 mg溶于20 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，加入不同量的EGCG(同1.3.2)，充分混合后使用高速均質機以10 000 r/min均質30 s，重復3次，測量均質后的體積V0，靜置30 min后測量泡沫體積V30，米糠蛋白的起泡能力和泡沫穩定性計算公式如下：

1.3.12 米糠蛋白乳化性和乳化穩定性的測定

準確稱取米糠蛋白200 mg溶于去離子水中，配置1 mg/mL的米糠蛋白溶液，在米糠蛋白溶液中加入不同量EGCG(同1.3.2)，取12 mL蛋白溶液和4 mL大豆油混合。然后采用高速均質機以10 000 r/min均質2 min，取20 μL米糠蛋白-大豆油乳狀液與5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉用渦流振蕩器混合均勻，在500 nm處測定吸光度。米糠蛋白的乳化性和乳化穩定性計算公式如下：

式中：N表示稀釋倍數；C表示樣品溶解液中蛋白質濃度；φ表示油相所占的分數。

1.3.13 數據分析

所有實驗平行測定3 次。采用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8處理數據和繪制圖形。結果用平均值±標準差的形式表示。指標比較采用最小顯著差異法，取95%置信度(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 EGCG對米糠蛋白總巰基含量的影響

加入不同比例EGCG米糠蛋白的總巰基含量如圖1所示。隨著EGCG添加比例的增大，總巰基含量由41.26 nmol/mg 逐漸降低至25.99 nmol/mg。在研究兒茶素與黃笛鯛肌原纖維蛋白相互作用以及EGCG與乳清蛋白相互作用的文獻中，也同樣發現隨著兒茶素和EGCG添加濃度的增加，黃笛鯛肌原纖維蛋白和乳清蛋白總巰基含量逐漸下降[5,10]。EGCG可使得蛋白質巰基去質子化形成硫醇離子(RS-)，蛋白質半胱氨酸殘基中的硫醇基團活性很強，很容易與EGCG結合，從而導致蛋白質總巰基含量下降[5]。

圖1 EGCG對米糠蛋白總巰基含量的影響

2.2 EGCG對米糠蛋白二級結構的影響

圖2 EGCG對米糠蛋白去卷積酰胺Ⅰ帶的影響

表1 EGCG對米糠蛋白二級結構含量的影響

蛋白二級結構波數/cm-1組成/%對照0.050.10.150.20.51氨基酸側鏈1 609～1 6123.113.643.644.044.676.668.65β-折疊1 618～1 6204.925.276.396.516.548.7210.25β-折疊1 626～1 6329.868.829.6310.7210.0813.0914.54β-折疊1 638～1 64113.2113.5313.1512.8412.0713.5613.27無規卷曲1 646～1 64913.6113.4614.2214.6914.4713.2611.44α-螺旋1 653～1 65718.8218.0217.9817.2517.0515.6014.57無規卷曲1 662～1 66716.7616.7016.5916.1516.8414.3312.50β-轉角1 670～1 67812.4312.6710.9811.1410.858.788.88β-折疊1 687～1 6927.287.897.426.667.456.005.91α-螺旋總量18.8218.0217.9817.2517.0515.6014.57β-折疊總量35.2735.5036.5836.7236.1341.3743.97β-轉角總量12.4312.6710.9811.1410.858.788.88無規卷曲總量30.3730.1630.8130.8431.3127.5923.93氨基酸側鏈總量3.113.643.644.044.676.668.65

2.3 EGCG對米糠蛋白表面疏水性的影響

加入不同比例EGCG的米糠蛋白表面疏水性如圖3所示。隨著EGCG添加比例的增大，米糠蛋白表面疏水性由903.21下降到41.58。在EGCG與乳清蛋白[5]、大豆分離蛋白[14]和去折疊態β-乳球蛋白[3]相互作用時也發現，隨著EGCG添加比例的上升，這幾種蛋白質表面疏水性都逐漸下降。EGCG分子含有多個羥基，EGCG可與蛋白質通過疏水作用結合形成復合物，一方面降低蛋白質表面疏水性氨基酸殘基的數量，另一方面增加蛋白質表面的親水性[5, 14]；此外，EGCG還可導致蛋白質構象發生變化，使蛋白質中的一些疏水基團埋藏在分子內部[15]，這些因素都可導致蛋白質表面疏水性下降。

圖3 EGCG對米糠蛋白表面疏水性的影響

注：米糠蛋白質量濃度為1 mg/mL；1～7 ：EGCG質量濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.5、1 mg/mL；溫度為298 K。圖4 EGCG對米糠蛋白內源熒光光譜的影響

2.4 EGCG對米糠蛋白熒光光譜的影響

加入不同比例EGCG的米糠蛋白熒光光譜如圖4所示，隨著EGCG添加比例的增加，米糠蛋白的熒光強度明顯下降，最大發射峰從360.2 nm逐漸紅移至 396.2 nm。EGCG與α-乳清蛋白[6]、β-酪蛋白[15]、豬肌原纖維蛋白[16]相互作用時蛋白質內源熒光也出現了類似現象。內源熒光強度快速下降說明EGCG可導致米糠蛋白內源熒光淬滅，表明EGCG與米糠蛋白色氨酸殘基之間存在較強的相互作用[14,16]。

表2 EGCG對米糠蛋白分子質量分布的影響

此外，內源熒光光譜中最大熒光峰位紅移表明米糠蛋白中色氨基酸殘基微環境由疏水性逐漸向親水性轉變，米糠蛋白多肽空間結構逐漸處于更加延伸的狀態[17]。

2.5 EGCG對米糠蛋白分子質量分布的影響

天然以及經EGCG處理的米糠蛋白的分子質量分布如表2所示。未加入EGCG的米糠蛋白分子質量分布圖呈現2個吸收峰，對應的保留時間分別為11.66、12.09 min。吳偉等[18, 19]制備的米糠球蛋白和谷蛋白在類似的高效液相色譜條件下保留時間分別為10.81 min和11.35 min，由于制備米糠蛋白的原料和工藝不同，米糠蛋白各組分的含量和出峰時間略有差異，由此推斷保留時間為11.66 min的吸收峰可能是相對分子質量較大的球蛋白、清蛋白以及蛋白聚集體，保留時間為12.09 min的吸收峰可能是相對分子質量較小的谷蛋白和醇溶蛋白。當EGCG和米糠蛋白的質量比為0.1∶1時，在保留時間5.58 min處新增一個吸收峰，此吸收峰對應的蛋白質分子質量在1 000 ku左右，為蛋白質高分子質量聚集體；當EGCG和米糠蛋白的質量比為0.15∶1時，在保留時間10.73 min 處新增一個吸收峰，此吸收峰對應蛋白質低分子質量聚集體。隨著EGCG添加比例進一步增大，蛋白質低分子質量聚集體先增加后減少，高分子聚集體持續增加，表明EGCG與米糠蛋白相互作用時主要導致的是蛋白質交聯聚集。當EGCG和米糠蛋白的質量比為0.5∶1時，保留時間19.17 min呈現較大的吸收峰，此吸收峰對應游離態的EGCG[3]，表明EGCG與米糠蛋白的結合已經達到飽和。

2.6 EGCG對米糠蛋白電泳圖譜的影響

電泳可以反映EGCG對米糠蛋白亞基結構和共價交聯的影響。EGCG對米糠蛋白電泳圖譜的影響如圖5所示。隨著EGCG添加比例的增加，圖中各電泳條帶顏色深淺無顯著變化，條帶數目也沒有增加或者消失，表明EGCG對米糠蛋白亞基結構沒有影響，可能是由于EGCG與米糠蛋相互作用力為非共價作用力。

注：1～7分別代表EGCG與米糠蛋白質量比為0∶1、0.05∶1、0.1∶1、0.15∶1、0.2∶1、0.5∶1、1∶1。圖5 EGCG對米糠蛋白電泳圖譜的影響

2.7 EGCG對米糠蛋白功能性質的影響

加入不同比例EGCG的米糠蛋白的功能性質如表3所示。隨著EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的溶解性下降。胡思等[7]研究茶多酚與小麥面筋蛋白相互作用時也發現茶多酚可導致小麥面筋蛋白溶解度下降。EGCG含有酚羥基和沒食子酰基，這兩種活性基團均可與蛋白質發生較強的相互作用，可能會封閉蛋白質中大量的游離氨基和色氨酸，同時EGCG和蛋白可能復合生成某些不溶性聚合物，從而使得蛋白質溶解度下降[20, 21]。

表3 EGCG對米糠蛋白功能性質的影響

注：同一列中不同肩標小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

隨著EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的持水性、持油性先增加后下降，在EGCG和米糠蛋白的質量比為0.15 ∶1時達到最大值。胡湘蜀[22]研究茶多酚與大豆分離蛋白相互作用時也發現隨著茶多酚濃度的提高，大豆分離蛋白持水性、持油性同樣呈現先增加后下降的變化趨勢。隨著EGCG添加比例的增加，米糠蛋白持水性先增加后下降的原因可能是EGCG分子的活性羥基以非共價鍵與蛋白質分子交聯，可以使水分子進入蛋白分子內部，從而使蛋白質的持水性得到提高；隨著EGCG添加比例繼續增大，EGCG與米糠蛋白分子發生較大程度的交聯，EGCG與米糠蛋白的結合作用大于水合作用，從而導致蛋白質持水性下降，也可能是EGCG改變了蛋白質分子表面分布的極性基團，導致持水性改變[7, 23]。米糠蛋白持油性先上升后下降的原因：一方面可能是由于EGCG的活性基團和蛋白內部的氨基酸殘基接觸和反應，使得部分蛋白去折疊，蛋白緊密的組織結構變得疏松，分子間的孔隙率也有所提高，使更多的油能填充到增加的孔隙中；另一方面可能是由于氨基酸殘基側鏈含量上升，氨基酸提供的疏水基團含量上升導致持油性增加[22, 24]。隨著EGCG添加比例繼續增大，EGCG與米糠蛋白的交聯程度增大，兩者之間形成了不可溶性復合物，米糠蛋白與脂質的結合能力迅速降低，使得蛋白質持油性下降[22]。

隨著EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的起泡能力也呈現出先上升后下降的趨勢，在兩者質量比為0.2時達到最大值，米糠蛋白的泡沫穩定性呈現出先上升后下降的趨勢，在兩者質量比為0.15時達到最大值，與郭興鳳等[25]研究不同質量濃度茶多酚對大豆蛋白泡沫性質影響的趨勢相同。米糠蛋白起泡能力和起泡穩定性先上升后下降的原因可能是適量的EGCG提供的活性羥基與蛋白質殘基通過非共價鍵結合，蛋白質內部排斥展開，使蛋白質分子柔性增強，蛋白質能較快地在界面上展開，再加上形成的黏膜因為有適量的活性羥基而具有了較好的韌性，從而使得溶液的起泡性能達到較好的效果；隨著EGCG添加比例繼續增大，過多的活性基團已經占領了界面，在一定程度上阻礙了蛋白質分子在界面上吸附和展開，反而使氣泡性能下降[22, 25]。

隨著EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的乳化性和乳化穩定性變化趨勢較為復雜，當EGCG與米糠蛋白的質量比小于0.15∶1時，呈現先上升后下降趨勢，隨著EGCG添加比例繼續增大，乳化性和乳化穩定性再次上升，在EGCG和米糠蛋白的質量比為0.2∶1時達到最大值，隨后下降到最小值， 與胡湘蜀[30]研究不同質量濃度茶多酚對大豆分離蛋白乳化性和乳化穩定性影響的趨勢相同。EGCG導致米糠蛋白乳化性發生變化的主要原因可能是，適量的EGCG使米糠蛋白交聯，提高了米糠蛋白分子油水界面的吸附結合能力，增加了米糠蛋白的乳化功能，過量的EGCG會破壞膜的柔韌性，使蛋白乳化性能變差[22]。另一方面，蛋白質結構的變化也會降低蛋白質的界面吸附速率和重組的能力，例如，蛋白質二級結構中無規則卷曲結構含量的降低和表面疏水性下降，都會使其乳化性下降[26, 27]。因而，米糠蛋白乳化性能的變化是上述因素共同作用的結果。

3 結論

本研究將不同比例的EGCG與米糠蛋白在常溫下進行反應，研究EGCG對米糠蛋白結構和功能性質的影響，結果表明：隨著EGCG添加比例的增加，米糠蛋白總巰基含量逐漸減少，表明EGCG中的活性羥基可能與米糠蛋白的巰基發生相互作用。隨著EGCG添加比例的增加，米糠蛋白的β-折疊結構的含量大幅度增加，而無規卷曲、α-螺旋和β-轉角結構所占比例均逐漸減少，氨基酸殘基側鏈含量增加，表明EGCG對米糠蛋白的二級結構產生了較大影響。米糠蛋白的內源熒光強度下降且發生紅移，米糠蛋白的表面疏水性下降，這表明米糠蛋白的芳香族氨基酸殘基微環境由疏水性逐漸向親水性轉變。米糠蛋白分子質量分布表明EGCG與米糠蛋白相互作用生成了大分子聚集體。EGCG引發米糠蛋白結構變化的同時，導致其功能性質發生較大變化，隨著EGCG添加比例的增加，米糠蛋白溶解性下降，持水性、持油性、起泡能力、泡沫穩定性先增大后下降。米糠蛋白的乳化性和乳化穩定性呈現先上升后下降趨勢，后再次上升，最后下降。總的來說，采用適量的EGCG對米糠蛋白進行處理，可以在一定程度上提高其功能性質。