高粱醇溶蛋白-卡拉膠復合納米顆粒負載姜黃色素的特性研究

李興飛 陳 斌 陳國靖 龍 杰 華欲飛

(江南大學食品學院；食品科學與技術國家重點實驗室1，無錫 214122) (宣城柏維力生物工程有限公司2，宣城 242000)

高粱中含有6%～18%的蛋白質，包括球蛋白、清蛋白、醇溶谷蛋白和谷蛋白。醇溶蛋白是高粱蛋白主要存在形式，占總蛋白的77%～82%[1]，主要是由α-，β-和γ-三種類型構成[2]。高粱醇溶蛋白與玉米醇溶蛋白具有很多相似的物理化學性質，例如溶解度、摩爾質量、氨基酸組成和多肽結構等[3, 4]。但是，與玉米醇溶蛋白相比，高粱醇溶蛋白的疏水性更強，消化特性更差[5]。由于高粱蛋白的消化率低，高粱主要利用其中的谷蛋白用于釀酒發酵，丟棄的殘渣中含有大量的醇溶蛋白，造成資源浪費。高粱醇溶蛋白具有的較好的物理化學特性和生物相容性，可以被用來塑形成膜[6]；也可以作為包埋傳遞活性分子的理想載體[7]。目前，有關玉米醇溶蛋白作為輸送載體的相關報道十分廣泛[8-10]；但是，高粱醇溶蛋白的潛在應用仍然缺乏詳細而系統的研究。

姜黃素是從姜黃根中提取的一種黃色化合物，經體內和體外實驗證實具有抗氧化、抗癌等生物活性，是一種較為理想的食品和藥品原料[11]。但是，姜黃色素水溶性很差，化學性質不穩定，易在外部環境變化條件下發生降解，從而導致其生物活性利用率低。因此，姜黃色素一般是通過生物介質傳遞增強其穩定性，例如微球、粒子、生物膜、納米纖維等[12-14]。

本研究以高粱醇溶蛋白為原料，基于反溶劑法，以碳酸鈉為犧牲模板制備中空高粱醇溶蛋白納米顆粒，并根據靜電吸附作用形成卡拉膠包被層，從而獲得裝載姜黃色素的中空納米顆粒，增強姜黃色素的穩定性和體外釋放特性，提高姜黃色素產品在食品和藥品中的應用價值，同時為高粱醇溶蛋白的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

白高粱粉、胃蛋白酶、胰蛋白酶、卡拉膠、姜黃色素、氫氧化鈉、濃鹽酸、焦亞硫酸鈉、冰乙酸、Tween 20等分析純試劑。

1.1.2 儀器與設備

Himac CR21 GⅡ型冷凍離心機;多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀;Delta 320 pH計;CR 21G Ⅱ型冷凍離心機;UV-1500型分光光度計;LGJ-18型冷凍干燥機;傅里葉紅外光譜儀;Tecnai T20透射電子顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的提取

依照Taylor等[15]方法，略有修改。稱取0.5 kg高粱粉，加入2.5 kg 70%的乙醇水溶液，然后將12.5 g偏亞硫酸氫鈉和8.7 g冰醋酸加入上述混合物中，攪拌均勻并加熱至70 ℃，水浴恒溫震蕩提取1 h。將上述懸浮物經兩層濾紙真空抽濾，除去不溶物。將過濾液在50 ℃下真空抽濾，旋轉蒸發揮干酒精，收集沉淀組分。將以上沉淀用去離子水沖洗3次，濾紙過濾，收集沉淀并冷凍干燥。將所提粗蛋白粉末用正己烷(1∶2 g/mL)浸泡脫脂3次，置于通風櫥，揮干正己烷，-20 ℃貯存備用。

1.2.2 負載姜黃色素高粱醇溶蛋白納米顆粒的制備

在70 ℃水浴循環下，用70%乙醇配制質量濃度為2.0%的高粱醇溶蛋白溶液，磁力攪拌1 h至完全溶解，冷卻至室溫，離心(6 000 r/min, 30 min)去除少量不溶性顆粒。在避光條件下，按照姜黃素/高粱醇溶蛋白(芯壁比)質量比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30向上清液加入相應質量的姜黃色素，置于暗處磁力攪拌24 h，使姜黃色素完全溶解吸附。同時配制2%的碳酸鈉水溶液，待用。

1.2.2.1 中空納米材料：參考Xu等[16]方法，略有修改。將2%的碳酸鈉水溶液與無水乙醇3∶7(V/V)混合，制備得到分散均勻的碳酸鈉乙醇懸浮液。將以上懸浮液按照體積比1∶2加入到負載姜黃色素的高粱醇溶蛋白溶液中，磁力攪拌10 min，使其充分混合。在磁力攪拌條件下，將以上混合溶液按照體積比1∶20緩慢加入到去離子水中，使其通過反溶劑法分散形成納米顆粒，簡稱HNP。

1.2.2.2 實心納米材料：與制備中空納米粒子不同，將負載姜黃色素的高粱醇溶蛋白溶液直接按照體積比1∶20緩慢加入到去離子水中，使其通過反溶劑法分散形成納米顆粒。然后加入相應體積的碳酸鈉乙醇懸浮液(2%的碳酸鈉水溶液與無水乙醇3∶7混合)，以保證實驗條件與1.2.2.1一致；通過以上步驟制備的納米顆粒簡稱SNP。

1.2.3 負載姜黃色素的高粱醇溶蛋白-卡拉膠復合納米顆粒的制備

配制質量濃度為0.1%的卡拉膠溶液，按照體積比1∶5與上述1.2.2制備的中空和實心納米溶液分別混合均勻，磁力攪拌10 min，然后用2 mol/L HCl調節混合溶液pH至4.0，使卡拉膠和高粱蛋白發生靜電吸附，形成中空復合納米顆粒和實心復合納米顆粒，低溫冷凍干燥，分別簡稱為C-HNP和C-SNP。

1.2.4 Zeta電位測定和粒徑測定

分別取新鮮制備的納米溶液和凍干復水后的納米顆粒溶液，在25 ℃下，用Zetasizer Nano電位儀測定Zeta電位、粒徑分布以及PDI，每個樣品重復3次測定。PDI 是指多分散性系數，PDI 越小，代表體系粒徑越均勻，一般認為小于0.4 較好。

1.2.5 微觀結構觀察

采用(FEI Tecnai T20)透射電子顯微鏡觀察制備的復合納米顆粒的微觀結構。取18 μL樣品液滴在銅網上，30 s后用濾紙吸去溶液，然后加入相同體積的固定劑，30 s后濾紙再次吸凈。放大倍數30 000～50 000下觀察形態結構。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析

取10 mg凍干的樣品顆粒與0.1 g KBr粉末于瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下，研磨均勻，取適量樣品置于壓片槽中，經壓片后進行衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析，波數范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次。

1.2.7 姜黃色素包埋率和負載率

取10 mg凍干樣品用2 mL乙酸乙酯沖洗2遍，去除未吸附的姜黃素。收集上述樣品，繼續用80%乙醇提取姜黃色素，離心(4 000 r/min，15 min)，收集上清液，并用80%乙醇稀釋一定比例，用紫外分光光度計在425 nm下測定吸光度。在相同實驗條件下，配制一系列濃度(0、1、2、3、4、5、6、7 μg/mL)的含有姜黃色素的80%乙醇溶液，于425 nm下測定吸光度，繪制標準曲線(y=0.077 8x+0.005 4，R2=0.998 9)。由標準曲線計算得到復合納米顆粒中的姜黃色素含量，根據式(1)和式(2)計算復合納米顆粒的包埋率和負載率：

(1)

(2)

1.2.8 體外模擬消化實驗

體外模擬消化實驗根據Xiao等[17]方法，略有修改。準確稱取姜黃色素1.0 mg, 并稱取相應質量的中空納米顆粒和實心納米顆粒粉末，使其含有相同質量的姜黃色素。分別將以上3種樣品混合于18 mL的含有0.5%的吐溫 20的 0.1 mol/L 鹽酸溶液；在攪拌狀態下37 ℃水浴10 min。然后加入15 mg/mL的胃蛋白酶溶液2 mL (0.1 mol/L 鹽酸溶液配制)，繼續磁力攪拌，開始計時胃蛋白酶模擬消化1 h。1 h消化后，加入30 mg/mL的胰蛋白酶溶液10 mL，調節pH至 7.4，37 ℃計時攪拌2 h，模擬胰蛋白酶消化。分別在第0、30、60、90、120、150、180 min吸取250 μL溶液，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清測定姜黃色素濃度。

2 結果與討論

2.1 負載姜黃色素高粱醇溶蛋白納米顆粒制備的條件優化

納米粒子的粒徑及電位分布是表征納米粒子穩定性等特性的重要指標。實驗首先研究了不同芯材比例對制備的納米粒子粒徑及Zeta電勢的影響，結果如表1所示。結果表明，實驗制備的負載姜黃色素中空納米顆粒平均粒徑在62～77 nm，負載姜黃色素實心納米顆粒的平均粒徑約為102～123 nm，后者約為前者的2倍。Xu等[18]研究表明，通過Na2CO3作為犧牲模板自組裝的玉米醇溶蛋白中空納米顆粒相比實心納米粒子，其平均粒徑顯著減小。該研究認為，70%乙醇中分散形成的Na2CO3晶體可以作為納米顆粒生長的非均相成核位點，從而有效控制形成的納米顆粒尺寸增長。本實驗中，兩種納米顆粒制備原理的差異主要在于Na2CO3晶體是否參與蛋白質納米顆粒的形成。在HNP制備過程中，Na2CO3晶體是與高粱蛋白分子包裹在一起的，當兩者共同加入到水溶液中時，由于蛋白質的強疏水性，高粱蛋白通過反溶劑法自組裝形成納米顆粒，并且其尺寸增長受控于Na2CO3晶體；于此同時，被包裹的Na2CO3晶體由于其極強的水溶解性，快速從高粱蛋白納米顆粒內部釋放到外部的水溶液介質中，從而促使納米顆粒形成了內部中空結構。與之相反，在SNP制備過程中，高粱醇溶蛋白首先通過反溶劑法自組裝形成實心納米顆粒， Na2CO3晶體并未參與納米顆粒的形成，后續步驟中再次加入Na2CO3晶體未對納米顆粒形態結構造成影響。因此，與實心蛋白納米顆粒相比，通過Na2CO3晶體作為犧牲模板組裝構建的高粱醇溶蛋白中空納米顆粒具有更小的平均粒徑。在考察的芯材比例范圍內，兩種納米顆粒的Zeta電位變化范圍在-35～-38 mV，這表明兩種制備工藝對所形成的納米粒子電勢沒有顯著性影響，較高的電勢絕對值可以保證制備的納米粒子具有較高的物理穩定性。但是，由于兩種納米粒子是在Na2CO3存在的堿性環境下制備的，因此他們僅在堿性pH范圍(pH 7～10)內保持穩定；當調節pH至蛋白質等電點附近時(pH 5.3)，蛋白質之間的靜電斥力作用較弱，顆粒因疏水相互作用而發生大量聚集沉淀。因此，納米顆粒的酸性pH穩定性將關系到其在體內胃消化環境下的穩定特性。

表1 負載姜黃色素的兩種高粱蛋白納米顆粒劑 的粒徑、多分散性系數(PDI)及電位

注：HNP代表負載姜黃色素的中空納米材料；SNP代表負載姜黃色素的實心納米材料。

如表2所示，隨著芯材比例的降低，兩種納米復合顆粒對姜黃色素的包埋率均在不斷的降低，尤其是芯壁比條件1∶5下，包埋率相較于1∶10發生顯著降低(P<0.05)。當芯壁比1∶5時，姜黃色素濃度已經達到了壁材的過飽和狀態，不利于納米顆粒的制備及姜黃色素的包埋[19]。在芯壁比1∶30～1∶5范圍內，復合納米顆粒的負載率隨著姜黃色素添加量的增加而不斷上升，最大負載率出現在1∶5芯壁比條件下。綜合考慮包埋率和負載率效果，在芯壁比1∶10條件下所制備的復合納米顆粒較好。

表2 芯壁比對復合納米顆粒包埋率與負載率的影響

注：HNP代表負載姜黃色素的中空納米顆粒；SNP代表負載姜黃色素的實心納米顆粒。

2.2 卡拉膠包被對負載姜黃色素高粱醇溶蛋白納米顆粒性質的影響

兩種高粱醇溶蛋白納米顆粒對姜黃色素的最大包埋率均小于70%，為了進一步提高納米顆粒的包埋率以及酸性pH條件下的穩定性，研究多糖包被對納米顆粒包埋效果的影響，結果見表3。結果表明，隨著芯壁比的逐漸降低，兩種納米顆粒的包埋率在逐漸上升，但是當芯壁比達到1∶15時，其包埋效率上升趨勢不明顯，且此時負載率表現出急劇下降趨勢。C-HNP和C-SNP對姜黃色素的最大包埋率均超過了90%。在相同的實驗條件下，C-HNP比C-SNP具有更高的姜黃色素包埋能力，尤其是當芯壁比例較高時，例如1∶10和1∶5；這可能與中空納米顆粒的結構有關，使得一部分被包埋分子可以進入納米顆粒內部。綜合考慮納米顆粒的包埋率和負載率，選擇1∶10芯壁比制備復合納米顆粒的綜合效果最好。

表3 卡拉膠包被對復合納米顆粒包埋率、負載率的影響

注：C-HNP代表卡拉膠-高粱蛋白中空納米顆粒；C-SNP代表卡拉膠-高粱蛋白實心納米顆粒。

在最佳實驗條件下，對冷凍干燥制備的卡拉膠-高粱蛋白納米顆粒進行復水溶解，并測定其粒徑和Zeta電位變化，以表征納米顆粒的穩定性。如表4所示，在最佳芯壁比1∶10下，中空和實心卡拉膠-高粱蛋白納米顆粒的平均粒徑分別為71.35 nm和135.4 nm，PDI較小，與單一高粱蛋白納米顆粒相比，平均粒徑僅發生略微增加，這表明包被的卡拉膠分子層較薄，沒有引起納米顆粒的聚集增大或者納米顆粒結構的坍塌導致粒徑縮小問題，納米顆粒仍然是穩定的。由于卡拉膠為強陰離子多糖，可以通過靜電作用吸附于高粱蛋白表面上，形成一層穩定的負電荷層；因此形成的納米顆粒Zeta電勢主要取決于卡拉膠分子。表4結果顯示，兩種卡拉膠-高粱蛋白納米顆粒的Zeta電勢分布于-37～-38之間，較高的電勢絕對值可以保證制備的納米溶液具有長期的物理穩定性。

表4 最佳實驗條件下卡拉膠-高粱蛋白納米顆粒的 凍干復水后粒徑、多分散性系數及電位

注：C-HNP代表卡拉膠-高粱蛋白中空納米顆粒；C-SNP代表卡拉膠-高粱蛋白中空納米顆粒。

2.3 透射電鏡對卡拉膠-高粱蛋白復合納米顆粒形貌觀察

兩種復合納米顆粒的微觀結構觀察結果如圖1所示。兩種復合納米顆粒呈規則的球形，粒子與粒子之間相互黏連較少。Zhang等[20]認為具有空芯結構的顆粒或膠囊經過透射電子穿透后一般會形成為內部透光度高，外部透光度低的暗環形態結構。如圖1a所示，透射電鏡(TEM)結果表明卡拉膠-高粱蛋白中空復合納米顆粒同樣形成了內部較亮、外部較暗的形態結構，分界線處形成了一層厚度約為幾納米的“殼”，如圖1a中雙箭頭所示，這說明納米顆粒內部存在一個中空的腔。相反地，實心復合納米顆粒整體透光度均一，顏色較暗(圖1b)，因為實心納米顆粒比中空納米顆粒能阻擋更多的電子進入[16]。Xu等[16]在研究玉米醇溶蛋白中空納米顆粒的微觀結構形態時觀察到其殼厚度約為2～10 nm，內部空腔直徑約為20～50 nm，且粒子平均粒徑為60 nm，顯著性地小于實心納米顆粒。

本實驗中，卡拉膠-高粱蛋白中空復合納米顆粒的粒徑在50～60 nm之間，卡拉膠-高粱蛋白實心復合納米顆粒的粒徑在80～100 nm，這與通過Zeta納米粒徑測定的結果基本一致，證實了中空納米粒子具有更小的平均尺寸。TEM觀察到的卡拉膠-高粱蛋白實心復合納米顆粒的粒徑略小于動態光散射技術(DLS)測定值，這是因為DLS測定的是具有一定水合半徑的粒子大小，而TEM需要樣品觀察前進行脫水干燥。兩種技術觀察到的粒徑差異已經被廣泛報道[21]。

注：放大倍數為30 000×，對應標尺為50 nm。圖1 卡拉膠-高粱蛋白中空復合納米顆粒(a)和卡拉膠- 高粱蛋白實心復合納米顆粒(b)的透射電子顯微鏡圖

2.4 傅里葉紅外變換光譜分析

圖2 姜黃色素、卡拉膠、高粱醇溶蛋白及中空和 實心納米顆粒的傅里葉紅外變換譜圖

2.5 不同貯藏時間下的復合納米顆粒穩定性

在食品的加工儲藏過程中，延緩產品的腐敗變質，對提高產品的貨架期有重要意義，因此對制備的兩種復合納米材料進行貯藏時間實驗，以觀察制備納米粒子的貯藏穩定性。如表5所示，兩種復合納米顆粒在30 d的貯藏時間內，其平均粒徑略微增大，PDI值也在略微增高，但整體變化不明顯，這說明兩種復合納米顆粒的貯藏穩定性較高。值得注意的是，實心納米材料似乎相較于中空納米材料更不穩定，表現為更高的PDI和平均粒徑變化值。

表5 儲藏時間對卡拉膠-高粱蛋白復合納米顆粒 平均粒徑與多分散系數PDI的影響

注：C-HNP代表卡拉膠-高粱蛋白中空納米顆粒；C-SNP代表卡拉膠-高粱蛋白實心納米顆粒。

2.6 復合納米顆粒的體外消化釋放

圖3 體外模擬條件下姜黃色素的溶解釋放特性

如圖3所示，對于天然姜黃色素，在模擬胃液消化結束后，僅有約21%的姜黃素以溶解狀態釋放出來；在進一步模擬腸液消化過程，其溶出速率基本維持不變(P> 0.05)。由于天然姜黃色素在0.5%吐溫溶劑中溶解度較低(約20%)，并且在堿性pH的小腸環境中易發生降解，因此可以推斷天然狀態的姜黃色素生物吸收利用較低。當姜黃色素被復合納米顆粒包埋后，其體外釋放率明顯增高，表明以溶解狀態和分散納米粒子狀態存在的姜黃色素濃度明顯增加，姜黃色素被人體胃腸道消化吸收利用的機會明顯增加。在模擬腸液消化2 h后，實心和中空復合納米顆粒的最大姜黃色素釋放率分布達到69%和61%。中空納米顆粒的姜黃色素釋放率略低于實心納米顆粒，這可能是因為部分姜黃色素分子被包埋在納米顆粒內部，阻礙了其釋放途徑。這個結果還說明中空納米顆粒相比實心納米顆粒具有更高的藥物控釋能力。因此，兩種復合納米顆粒均顯著地增加了姜黃色素的體外消化釋放率。

3 結論

本實驗采用反溶劑法，利用高粱醇溶蛋白與卡拉膠的相互作用，制備了兩種類型的負載姜黃色素復合納米顆粒。實驗最佳條件為：芯壁比為1∶10，中空和實心納米顆粒平均粒徑分別為71 nm和135 nm，電位為-37.7 mV和-38.2 mV，包埋率分別為89.6%和84.1%，負載率分別為8.01%和7.49%。透射電鏡顯示中空復合納米顆粒形成了內部較亮，外部較暗的形態結構；實心復合納米顆粒整體規則，顆粒較大。紅外光譜結果顯示，相較于高梁醇溶蛋白，兩種復合顆粒中部分波峰均發生藍移，說明卡拉膠和姜黃素分子與蛋白質分子間有較強的靜電以及疏水相互作用。兩種復合納米顆粒在30 d的貯藏時間內，平均粒徑及PDI均未發生明顯變化，表明穩定性較好。體外消化模擬實驗結果表明，兩種復合納米顆粒均顯著地增加了姜黃色素的體外消化釋放率，但是中空納米顆粒具有更高的控釋能力。本研究結果為高粱及其副產物中醇溶蛋白的高附加值利用提供了一定的參考。