燕麥抗凍蛋白對面筋蛋白凍融穩定性的影響

張艷杰 張 垚 崔 悅 艾志錄 毋修遠

(河南農業大學食品科學技術學院1，鄭州 450002) (農業農村部大宗糧食加工重點實驗室; 河南省冷鏈食品工程技術研究中心2，鄭州 450002) (江南大學食品學院3，無錫 214122)

隨著世界食品工業的發展，冷凍食品逐漸成為潮流，冷凍技術具有便于貯藏、符合市場需求、能夠標準化生產的優點，被廣泛應用在食品保存中，其中冷凍面團也得到了迅速發展。冷凍面制品采用冷凍原理加工，降低了食品內部各種化學活動能量，不借助任何添加劑，抑制面食制品的老化，延長保質期[1]，解決了面制品，如饅頭、包子、面包等貨架期短、易老化的問題，有著廣闊的發展前景[2]。但是，冷凍面制品也存在許多問題，凍藏后面團酵母產氣性的下降及面筋網絡三維結構的破壞等會造成最終產品質量品質的降低，導致面制品，比如冷凍餃子、餛飩外皮有裂紋，面包體積縮小等問題，食用品質上表現為表皮脆化、失去彈性、口感變差等[3]。

小麥面筋蛋白是冷凍面制品中的重要影響因素，由決定面團延展性的醇溶蛋白和決定面團彈性的麥谷蛋白組成[4]。李雪紅等[5]發現凍藏0～7 d小麥面筋蛋白的黏性、咀嚼度等變化較大，凍藏14～28 d彈性、回復性等變化較大；趙雷[6]發現隨著凍藏時間的延長，小麥面筋蛋白的網絡結構弱化、麥谷蛋白的熱穩定性下降，其裂解溫度的下降趨勢與小麥面筋蛋白網絡結構弱化的趨勢一致；另外由于自由水含量的減少，引起濃縮反應，使蛋白質分子內和分子間二硫鍵交換反應增多[7]。Kennedy[8]研究發現凍融循環后的麥谷蛋白發生了解聚，導致了面筋結構的弱化。汪星星[9]研究發現，添加食品膠(CMC、黃原膠、K-卡拉膠)能夠有效抑制小麥面筋蛋白的解聚及二級結構的變化。Ribotta等[10]研究發現凍藏過程中面團品質的下降，可能是谷蛋白由于冰晶的重結晶而發生了解聚行為。

抗凍蛋白(AFPs)又稱熱滯蛋白或冰結構蛋白，是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱[11]，具有非依數降低冰點、抑制重結晶、降低過冷卻點、修飾冰晶形態等性質[12]。植物抗凍蛋白主要存在于寒冷、高海拔地區的植物體內[13]。Griffith等[14]首次提出并從冬黑麥質體外提取到了植物AFPs；費云標等[15]從冬季沙冬青葉片中分離出并純化了抗凍糖蛋白；張峰等[16]采用浸出離心法從女貞葉中提取到了一種類似于沙冬青和黑麥的抗凍蛋白。

燕麥為禾本科植物，與小麥的生長期大致相同，是我國主要的高寒作物之一，但適應性與抗寒性更強。作者前期從冷誘導的燕麥籽粒中經過一系列的分離純化步驟，得到電泳純的燕麥抗凍蛋白(AsAFPs)，熱滯活性為1.24 ℃，通過MALDI-TOF-MS/MS法進行序列鑒定，并對其氨基酸組成、等電點及相對分子質量、二級結構及表面溶劑可及性等進行了預測和分析。結果表明：AsAFP的氨基酸序列為VSSVISSSLF EKMLLHRGFY TYDAFIAAAK SFPAFATTGS TDVRKREVAA FLAQTSHETT GGWPTAPDGP YELGSTSDYF GRGPIQISYN YNYGAAGKAI GVDLLRNPDL VTSDNTVEFK TALWFWMTPQ SPKPSSHDVI TGRWSPSSTD KAAGRVPGYG VLTNIIDGGV ECGKGQESHV ADRIGYYKDN LDCYNQKPFA，與Endochitinase具有最大匹配度；AsAFP具有高親水性氨基酸殘基比例；其理論等電點為6.08，相對分子質量為21 728.18；二級結構中含有大量的無規則結構，富含α-螺旋結構，且具有較高的表面溶劑可及性[17]，與大麥籽粒抗凍蛋白特征相似[11]。植物AFPs由于其天然的來源，較其他食品添加劑有更大的優勢，在冷凍食品的儲藏、運輸及解凍過程中抑制冰晶重結晶，對改善冷凍面制品的品質具有重要作用。因此，研究植物AFPs在冷凍面制品體系中的作用，探索其應用規律非常必要。本實驗對燕麥抗凍蛋白(AsAFPs)對凍融循環后小麥面筋蛋白的持水率、持油性、乳化性和乳化穩定性、二級結構以及水分分布的影響進行研究，對深刻理解AsAFPs的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

燕麥：市售；谷朊粉(小麥面筋蛋白)；金龍魚調和油。

1.2 主要試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸、硝酸銀、硫酸銨，均為分析純。

1.3 主要儀器與設備

JJ-1型增力電動攪拌器；高速離心機；冷凍干燥機；高速分散器；高速粉碎機；傅里葉紅外光譜儀；核磁共振儀；酸度計。

1.4 方法

1.4.1 燕麥抗凍蛋白(AsAFP)的提取

參照張艷杰[12]的方法，從燕麥籽粒中提取燕麥抗凍蛋白。挑選完整、健康的燕麥種子，將其儲存到-18 ℃(至少4周)進行冷誘導。冷誘導后的燕麥籽粒浸泡在3倍體積預冷的PBS(50 mmol/L，pH7.4)中，攪拌一定時間，將燕麥籽粒與浸泡提取液固液分離。浸泡液在4 ℃，10 000 r/min條件下，離心30 min。50%～100%飽和度的硫酸銨沉淀上清液，鹽析液在相同條件下離心，沉淀采用截留分子量為1 k的透析膜對PBS(5 mmol/L，pH 7.4)緩沖液透析至無SO42-檢出，濃縮凍干，即為AsAFP粗蛋白。凍干粉復溶于5 mmol/L PBS(pH 7.4)中，上陰離子交換柱(Q Fast-Flow Ion Exchange Column)進行分離，根據洗脫曲線收集不同洗脫峰，脫鹽凍干后檢測各組分的THA活性。活性最高的組分復溶于5 mmol/L PBS(pH 7.4)中，繼續使用陰離子交換柱(DEAE-Sepharose Fast-Flow column)進行梯度洗脫，分離后的組分按上述相同的方法脫鹽凍干，檢測各個組分的THA活性。活性最高的組分復溶于5 mmol/L PBS(pH 7.4)中，上凝膠色譜柱(Superdex 75 Gel-Filtration Column)進行分離。根據洗脫曲線收集不同洗脫峰，脫鹽凍干后進行各個組分的THA活性測定，活性最強的組分即為AsAFP。

1.4.2 小麥面筋蛋白的凍融循環設計

將小麥面筋蛋白與水按照1∶1.5的比例進行混合，作為對照組；將AsAFPs、小麥面筋蛋白、水按照0.005∶1∶1.5的比例進行混合，作為AsAFPs組[18]。將制備好的濕面筋蛋白用保鮮膜包裹后放入冷凍盒并做好標記，然后將其放入-30 ℃冰箱中，1 h后迅速轉移到-18 ℃中凍藏，2 d后取出小麥面筋蛋白放入4 ℃冰箱中解凍2 h，此為一次凍融循環。取出部分小麥面筋蛋白作為一次凍融樣品，其余繼續放入-18 ℃凍藏室進行凍藏。重復操作，共進行5次凍融循環。

1.4.3 干小麥面筋蛋白粉的制備

取出部分凍融循環后的小麥面筋蛋白進行冷凍干燥，2 d后取出，粉碎，過篩(100目)，即得干小麥面筋蛋白粉。將其放入自封袋并做好標記后，放入干燥器中保存備用[19]。

1.4.4 小麥面筋蛋白功能性質的測定1.4.4.1 小麥面筋蛋白持水率的測定

凍融循環前，取出部分濕小麥面筋蛋白稱重，記作m1；凍融循環后再次稱重，記作m2[20]。然后用式(1)計算小麥面筋蛋白的持水率：

1.4.4.2 小麥面筋蛋白持油性的測定

參照柳小軍[21]的方法進行測定。

1.4.4.3 小麥面筋蛋白乳化性和乳化穩定性的測定

參照柳小軍[21]的方法進行測定。

1.4.4.4 小麥面筋蛋白二級結構的測定

干小麥面筋蛋白粉的二級結構采用傅里葉紅外測定儀測定。測定參數：掃描范圍400～4 000 cm-1；掃描32次，分辨率4 cm-1。結果利用Omnic 8.2和Peakfit 4.12軟件對酰胺Ⅰ吸收峰(1 600～1 700 cm-1)進行處理，計算各子峰面積的占比[22]。

1.4.4.5 小麥面筋蛋白水分分布狀態的測定

凍融循環后的小麥面筋蛋白在4 ℃冰箱中解凍2 h后，采用核磁共振儀測定其弛豫時間T2。測定參數：90 °脈沖時間P90=14 μs，180°脈沖時間 P180=35 μs，采樣點數TD=67 022，主頻 SW=200 kHz，模擬增益 RG1=20，模擬增益RG2=3，累加次數 NS=8，回波個數 NECH=1 000，回波時間 TE=0.335 ms[12]。

1.5 數據分析

用Excel 2010、SPSS 16.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白持水率和持油性的影響

由圖1可知，隨著凍融循環次數的增加，小麥面筋蛋白的持水率由92.8%下降到87.8%，這可能是因為在凍藏初期，水分子形成的冰核不穩定，易發生分散遷移[23]，而隨著凍藏時間的延長，冰晶逐漸增大，進一步破壞了面筋網絡結構，導致水分部分散失，降低了持水能力[21]；另外，在解凍和重新凍藏期間，水分停留的位置會發生新的變化，冰晶也會在新的位置形成，從而加劇了對小麥面筋蛋白的破壞，導致持水率的降低[21]。AsAFPs組小麥面筋蛋白的持水率下降程度低于對照組，說明AsAFPs對凍融循環中小麥面筋蛋白水分的流失有一定的減緩作用，這可能是因為AsAFPs能夠降低冰晶對面筋網絡結構的破壞，從而維持它的持水能力。謝新華等[22]的研究表明，添加1% γ-PGA時，小麥面筋蛋白持水率較對照提高了29%；李淵等[24]的研究表明，大麥β-葡聚糖(BBG)的添加量為1%時，小麥面筋蛋白持水率(1.64±0.03) g/g，顯著高于對照組的(1.52±0.01) g/g，與本研究結果相似。

蛋白質存在一定的持油性，這是因為蛋白質的非極性區域與可以和脂質中的甘油三酯以疏水性作用形成蛋白質—脂質復合物。蛋白質中疏水鍵或者疏水基團的暴露程度是其持油性的主要因素，暴露程度越高，蛋白質的持油性越強[25]。

由圖1可知，在凍融循環過程中，小麥面筋蛋白的持油性呈現上升趨勢。這是因為凍融循環過程中小麥面筋蛋白體內的冰晶的變化導致小麥面筋蛋白的構象也發生了改變，使疏水基團的暴露程度升高，從而小麥面筋蛋白持油性上升[21]。AsAFPs組小麥面筋蛋白的持油性略低于對照組，這可能是因為AsAFPs作用于小麥面筋蛋白，抑制了重結晶現象，從而減少了疏水基團的暴露，促使持油性下降[26]。

圖1 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白持水率和持油性的影響

2.2 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

蛋白質的乳化性和乳化穩定性對食品的品質有一定的影響，它與蛋白質的自身結構、溶解度、表面疏水性、電荷情況、親水-親油平衡性等有關[27,28]，蛋白質的溶解性越好，乳化性也越好。

由圖2可知，小麥面筋蛋白在凍融循環過程中乳化性越來越差，而乳化穩定性的變化趨勢則相反。這是由于在凍融循環過程中小麥面筋蛋白變性加劇，溶解度降低，從而小麥面筋蛋白的乳化性降低，然而小麥面筋蛋白變性使蛋白親水-親油平衡性更強，從而小麥面筋蛋白的乳化穩定性越來越好[21]。AsAFPs組的乳化性優于對照組，這是由于AsAFPs在一定程度上抑制了冰晶的重結晶，使小麥面筋蛋白的溶解度高于對照組，從而乳化性高于對照組。同時，AsAFPs的加入可能抑制了小麥面筋蛋白的變性，進一步使得乳化穩定性低于對照組。姬曉月[29]的研究表明，添加0.75%的γ-PGA時，小麥面筋蛋白的乳化性及乳化穩定性降至最低值，和對照組相比分別減少了32.4%、36.5%。

表1 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白二級結構的影響

注：平均值±標準差；同一列不同字母上標之間代表存在顯著性差異(P<0.05)，相同字母上標之間代表無顯著性差異(P>0.05)，下同。

圖2 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

2.3 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白二級結構的影響

由表1可知，凍融循環且添加AsAFPs前后，小麥面筋蛋白的二級結構均以 β-轉角和β-折疊為主。經過凍融循環后，無規則卷曲、α-螺旋整體呈下降趨勢，β-折疊和β-轉角整體呈上升趨勢。α-螺旋含量的減少，是因為隨著凍融時間的延長，冰晶不斷生長重結晶，導致α-螺旋氫鍵彎曲，結構遭到破壞，形成小分子物質[9,30]。同時在凍融循環過程中，蛋白質的親水區域和疏水區域逐漸擴散，在新的區域出現新的分子交聯，從而改變了蛋白質的二級結構[9]。相較于對照組來說，AsAFPs組無規則卷曲、α-螺旋的變化不明顯。這是由于AsAFPs對于冰晶的修飾作用和重結晶的抑制作用可以有效抑制凍融循環對面筋結構的破壞[31]。

2.4 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白水分分布的影響

小麥面筋蛋白中水分子的存在狀態為位于0.1～10 ms的強結合水和弱結合水(峰1)、位于10～100 ms的可凍結的自由水(峰2)[22]。

由表2可知，隨著凍融循環次數的增加，小麥面筋蛋白的結合水含量逐漸減少，自由水含量逐漸增多，這說明在凍融循環過程中小麥面筋蛋白的結合水逐漸向自由水轉變。與對照組相比，AsAFPs組小麥面筋蛋白結合水和自由水的含量變化幅度均小于對照組，這說明AsAFPs可以降低凍融循環過程中水分的流動性，減少水分的遷移[21]。

表2 AsAFPs對凍融小麥面筋蛋白水分分布的影響

注：A21、A22分別表示峰1的峰面積和峰2的峰面積占峰面積總和的百分比。

3 結論

AsAFPs的加入能夠抑制凍融循環過程中水分的流失，減少疏水鍵的暴露，抑制冰晶的重結晶現象，減緩小麥面筋蛋白的持水率的下降，維持其持水能力；AsAFPs的添加影響了小麥面筋蛋白的構象和變性情況，減緩凍融處理對小麥面筋蛋白的持油性和乳化穩定性的改變；AsAFPs減緩了凍融過程中冰晶的破壞可能導致的對小麥面筋蛋白結構的伸展或聚集作用，使無規則卷曲、α-螺旋下降的幅度變小。