遮放鎮西番蓮果腐病的病原菌鑒定

李莉　蔣桂芝

摘 要 采用Koch法則對西番蓮病果樣品進行病原菌的分離和致病性測試，并采用形態學與分子生物學相結合的方法鑒定病原菌。結果表明，分離得到的編號為XFL20190803的病原菌為西番蓮果腐病的致病菌;對其進行的形態特征觀察及菌絲ITS1/ITS4序列在NCBI上的同源性比較結果表明，XFL20190803為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。

關鍵詞 西番蓮;果腐病;煙草疫霉菌

中圖分類號：S436.67 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.05.014

西番蓮（Passiflmne hdissims）又名百香果、雞蛋果、熱情果，原產于南美，是多年生熱帶、亞熱帶水果，其香氣濃郁，營養豐富，是一種高級的天然飲料，被譽為天然水果之王，深受消費者的喜愛。我國在廣西、廣東、海南、福建等地已有大量種植，近些年在云南省的種植面積大幅上升。2019年8月3日，在德宏州芒市遮放鎮的西番蓮種植地（24°11′30″N，98°11′2″E）觀察到西番蓮發生嚴重的果腐病，感病果濕腐，病斑邊緣水漬狀，病斑深入果肉，造成大量落果，發病率達到56%以上。為使西番蓮果腐病得到有效控制，筆者將感病果帶回實驗室，對西番蓮果腐病的病原菌進行研究，為廣大種植戶提供防治依據。

1 材料與方法

1.1 材料

分離材料：感病西番蓮采集于云南省德宏州遮放鎮西番蓮種植園;玉米培養基：玉米粉300 g、瓊脂20 g、水1 000 mL;瓊脂培養基：瓊脂17 g，水1 000 mL;皮氏培養液：Ca（NO3）2 0.40 g，KH2PO4 0.15 g，Mg（NO3）2 0.15 g，CaCl2 0.06 g，蒸餾水1 000 mL;致病接種果：來源于云南省熱帶作物科學研究所。

真菌菌絲DNA快速抽提試劑盒、ITS1/ITS4和PCR擴增等引物由生工生物工程（上海）技術服務有限公司提供。

1.2 方法

參照Koch法則[1]。

1.2.1 病原的分離培養

將病果用自來水清洗，表面用75%酒精消毒2次，用滅菌刀削去病斑表層皮，把斑病健交界組織切成大小4 mm×4 mm左右的方塊，把組織片置于玉米培養基上，在25 ℃條件下培養。3～4 d后出現一些菌落，用滅菌針挑取少量菌絲移接到玉米培養基上培養5 d，選取具有代表性的優勢菌落進行單菌絲分離、純化培養，得到純培養菌種用于致病性測試。

1.2.2 致病性測試

采用無傷接種。將無病蟲害、未成熟西番蓮果用自來水清洗，晾干表面的水分后待用;培養5 d的待測試菌種用接種針劃成約5 mm×5 mm的菌塊備用;將備好的測試菌塊有菌絲的一面分別貼到準備好的西番蓮果上，每個果接種1菌塊，對照組接種同樣大小的無菌玉米培養基塊。接種果放入保濕缸內，在25～28 ℃室溫下保濕培養，3～4 d后取出觀察接種感病情況。接種果致病后，隨即進行病原再分離，若分離得到與測試菌種一致，即可確認為致病菌。

1.2.3 病原鑒定

根據菌落和孢子囊的形態特征，參照《疫霉菌及其研究技術》[2]進行鑒定。

1.2.3.1形態鑒定

1）菌落形態：將純培養菌轉接到新玉米培養基上，在26 ℃室溫、自然光照條件下培養5 d，觀察菌落的生長情況、菌絲寬度等。2）孢子囊形成：將凹面玻片用75%的酒精表面消毒，晾干備用;用滅菌針挑取大小約2.5 mm×2.5 mm的菌塊置于玻片的凹面中，在凹面中加入約3 mL的皮氏培養液，將載有菌塊的玻片放于直徑9 cm培養皿中，再將培養皿置于25～28 ℃、自然光照下的培養缸中保濕培養24～48 h，觀察孢子囊的形成及形態特征。3）厚垣孢子形成：將在玉米培養基上接種病原菌的培養皿置于26 ℃、空氣濕度（RH）65%的室內、自然光照下培養10～15 d，觀察厚垣孢子的形成及形態。

1.2.3.2分子生物學鑒定

從菌絲體中提取DNA測序，利用ITS1/ITS4引物擴增、測序[3]，使用TIANGEN生化科技有限公司植物基因組試劑盒（DP320-02）進行真菌DNA提取，提取方法參照其說明。rDNA ITS區序列擴增及分析采用真菌核糖體基因轉錄間隔區通用引物ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴增該病菌5.8S rDNA及其兩邊的ITS1和ITS4基因片段。

擴增反應體系為：真菌DNA模板0.5～1.0 μL，ITS1（10 μm）1μL，ITS4（10 μm）1 μL，2×Master Mix12.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR擴增程序為：預變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環;最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物使用瓊脂糖凝膠回收，純化后的PCR產物克隆至Pgem-T-easy載體，由上海生物工程技術服務有限公司完成測序。將該病菌的ITS序列在NCBI網站上進行BLAST同源性比較，通過MEGA7軟件構建病原菌與近源物種的系統發育樹，分析和確定其分類地位。

2 結果與分析

2.1 病原分離

從12個病果上分離病原，每個病果取樣3個，36個樣品在玉米培養基上培養4 d后得到29個菌落，7個為真菌、細菌混合，得菌率80.5%。用滅菌針分別挑取少量菌絲移接到玉米培養基上培養4 d得到的29個菌落，經鏡檢為1種真菌。選取具有代表性的優勢菌落在瓊脂平板上培養3 d，進行單菌絲分離，得到純培養菌種，編號為XFL20190803，將XFL20190803在PDA上培養5 d，用于致病性測試。

2.2 致病性測試

將培養好的菌種打成直徑為5 mm的菌塊接種在備好的西番蓮果上，接種3 d后，接種菌塊表現出與田間一致的感病癥狀，對照組不感病。對出現癥狀的感病果進行病原再分離，得到與接種測試菌種一致，確認XFL20190803為西番蓮果腐病的致病菌。

2.3 病原鑒定

2.3.1 形態鑒定

2.3.1.1菌落形態

在玉米培養基上培養5 d，菌落白色，氣生菌絲生長旺盛，粗細不勻，寬5～10 μm。菌絲膨大，孢囊梗不規則分枝。

2.3.1.2孢子囊形成

在皮氏液培養36 h，形成大量的孢子囊，孢子囊卵圓形至近圓形，少數橢圓形，大小（23～60）μm×（19～50）μm，部分孢子上有絲狀附屬物。孢子囊具乳突，通常1個，少數2個，乳突大多明顯，半球形。孢子囊頂生，常不對稱，具脫落性，孢囊柄短，0.5～4.8 μm。排孢孔寬4.5～8.0 μm。

2.3.1.3厚垣孢子形成

菌落在玉米培養基上置于26 ℃、65%RH室內、室內自然光照下培養10 d，有厚垣孢子形成。厚垣孢子頂生或間生，近球形，直徑20～38 μm。

根據菌落形態和孢子囊、厚垣孢子的形態特征，鑒定為煙草疫霉菌。

2.3.2 分子生物學鑒定

利用ITS1/ITS4引物提取、擴增菌株DNA的ITS片段，獲得837 bp、668 bp 2個ITS序列（登錄號為MN922945、MN945401），在NCBI網站上進行同源性比較，通過BLAST搜索核酸數據庫顯示，MN922945與已報道Phytophthora nicotianae的ITS 序列中KT148947、MH341621相似度為99.28%和100%。通過MEGA7軟件構建病原菌XFL20190803 ITS系列與近源物種的系統發育樹，結果顯示病原菌XFL20190803與P. nicotianae的菌株CNRnico8RE和CNRnico62RC位于同一分枝，支持率為100%。

病原菌XFL20190803的形態鑒定與分子生物學鑒定結果一致，確定病原菌為P. nicotianae。

3 小結與討論

煙草疫霉（P. nicotianae）異名寄生疫霉菌（P. parasitica），寄主廣泛，我國已報道的寄主有番木瓜、番荔枝、菠蘿、陽桃、番木瓜、柚、柑桔、西番蓮、番石榴等熱帶果樹和草莓、煙草、黃瓜、蕃茄等[4]，以及文殊蘭、康乃馨等多種花卉共50多種，在臺灣種植區也分離到此病原菌[5]。在廣東種植區，有煙草疫霉侵染西番蓮幼苗的報道，在成齡株中很少發生，其侵染部位多見于葉片、莖蔓、果實中，少見于莖基部[6];在福建種植區也有西番蓮疫病發生，輕者引起落葉落果，重則引起整株或大面積死亡，其病原菌經鑒定為煙草疫霉[7]。有報道西番蓮果腐病由灰霉菌和菌核菌引起[4]。本研究證實在德宏州引起西蕃蓮果腐病的是煙草疫霉，與廣東省、福建省報道的一致，說明煙草疫霉在我國分布廣泛，對西番蓮的為害沒有地域間差異。西番蓮果腐病多發生于氣溫、濕度相對較高的雨季，病原菌煙草疫霉主要以游動孢子或孢子囊借助風雨或流水傳播而暴發流行，高溫高濕是其發生流行的主要環境因素。煙草疫霉是導致西番蓮果腐的主要致病菌，該病菌也可造成大面積植株死亡，因此要控制西番蓮果腐病的發生，應選擇在通風良好、土層深厚的緩坡地建園，同時在種植管理上采取相應的措施：1）種植抗病品種，如相對抗病品種黃果西番蓮;2）加固種植園中的棚架，減少風吹動對枝蔓、果實造成傷口;3）及時摘除病果，剪除染病枝葉和病死植株，并集中燒毀;4）在雨季做好田間管理，加強通風、土壤排水，多施有機肥、微生物菌肥，使根系生長旺盛，提高植株抗病性;5）及時控制害蟲的為害，減少害蟲對果實、枝蔓造成傷口;6）發病初期用甲霜靈、霜霉凈、甲霜·錳鋅等對病原菌有效的殺菌劑進行噴霧防治，每隔7～10 d噴施，連續噴2～3次，同時幾種藥劑交換使用，避免病菌產生抗藥性。

參考文獻：

[1] 方仲達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[2] 鄭小波.疫霉菌及其研究技術[M].北京：中國農業出版社，1995.

[3] White T J，Bruns T D，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M].New York：Academic Press，1990.

[4] 鍵渡德次.西番蓮果腐病[J].亞熱帶植物通訊，1990（2）：67-68.

[5] Ho H H，Ann P J，Chang H S.The Genus Phytophthora in Taiwan[M].TaiPei：Institute of Botany，Aeademia Sinica，1995.

[6] 戚佩坤.廣東果樹真菌病害志[M].北京：中國農業出版社，2000.

[7] 西蕃蓮病害研究課題組.西蕃蓮疫病的研究[J].熱帶作物學報，1993，13（1）：75-78.

（責任編輯：劉昀）

收稿日期：2020-01-16

作者簡介：李莉（1972—），女，湖南祁東人，本科，農藝師，研究方向為熱帶作物栽培技術推廣。

※為通信作者，E-mail： 316606049@qq.com。