湖州地區漁用飼料中四環素類藥物殘留分析

徐磊　盛鵬程　屠仁千　孫博懌

摘要? ? 為了解湖州地區漁用飼料中抗生素的污染水平，利用超高效液相色譜-串聯質譜儀，對湖州地區漁用飼料中的土霉素、金霉素、四環素和強力霉素開展了檢測分析。結果表明，飼料中四環素類抗生素的加標回收率很低，需要用基質加標的方法去定量才能保證回收率以滿足試驗要求。在18份飼料樣品中，共有8份飼料樣品中測出1～3種四環素類抗生素，檢出率為44.4%;其中金霉素的檢測率最高，為33.3%。不同養殖品種所用的飼料中四環素類抗生素含量存在差異，這一方面與養殖模式有關，另一方面也與養殖場的管理混亂有關。

關鍵詞? ? 漁用飼料;四環素類抗生素;回收率;污染水平;浙江湖州

中圖分類號? ? S816.7? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）09-0217-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? In order to understand the pollution level of antibiotics in fishery feed in Huzhou area，the detection and analysis of oxytetracycline，chlortetracycline，tetracycline and doxycycline in fishery feed in Huzhou area were carried out by using ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry.The results showed that the recovery rate of tetracycline antibiotics was very low，and it needs to be quantified by matrix addition to ensure that the recovery rate can meet the experimental requirements.Among the 18 feed samples，1-3 kinds of tetracycline antibiotics were detected in 8 feed samples，the detection rate was 44.4%，among which the detection rate of chlortetracycline was the highest（33.3%）.The content of tetracycline antibiotics in the feed of different breed was different.On the one hand，it was related to the breeding mode;on the other hand，it was also related to the management confusion of the farm.

Key words? ? fishery feed;tetracycline antibiotic;recovery rate;pollution level;Huzhou Zhejiang

抗生素是生物（包括微生物、植物和動物）在其生命活動過程中所產生的（或由其他方法獲得的）有機代謝產物，能在低微濃度下選擇性地抑制或影響其他生物的次級代謝產物及其衍生物[1]。其中，四環素類抗生素（tetracyclines，TCs）是由鏈霉菌產生的一類廣譜抗生素[2]，包括金霉素（chlortet-racycline）、土霉素（oxytetracycline）、四環素（tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺基四環素等。作為目前我國生產和使用最廣泛的抗生素之一，四環素類抗生素被廣泛地運用于水產養殖過程中，其中一種方法便是將抗生素添加到飼料中。

飼料中大量添加四環素類抗生素會導致藥物在生物體內的殘留以及抗藥菌株的產生[3-5]，目前許多國家對飼料中添加四環素類進行了嚴格的監控[6-7]。我國在2018年4月，由農業農村部印發《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案（2018—2021年）》，力爭通過3年時間，實施養殖環節獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作，而藥物飼料添加劑計劃將于2020年全部退出。

浙江湖州自古被譽為絲綢之府、魚米之鄉，是我國著名的十大淡水魚養殖基地。漁業作為湖州農業的首位產業，2018年漁業總產值已突破100億元，然而湖州地區漁用飼料中抗生素的殘留情況研究目前仍是空白。本研究以湖州水產養殖中主要使用飼料為研究對象，建立一套方便快捷的四環素類檢測方法，并對四環素類抗生素的污染水平進行初步分析，以了解飼料中四環素類抗生素的殘留狀況。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 樣品采集

采集時間為2017年4月，飼料來自于湖州地區的水產養殖場，采集點分布情況見表1，養殖品種主要選擇的是湖州地區最主要的養殖品種，采樣點主要分布于東、西苕溪周邊以及南太湖沿岸（圖1）。

1.2? ? 儀器和材料

超高效液相色譜串聯質譜儀（TQ MS/I-CLASS系列，美國Waters公司）;旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）;氮吹儀（美國Orgnomation公司）;冷凍干燥機（美國Labconco公司）;固相萃取裝置（美國SUPELCO公司）。

鹽酸土霉素（OTC）、鹽酸金霉素（CTC）、鹽酸四環素（TC）、鹽酸強力霉素（DOX）均來自德國Dr. Ehrensorfer公司。

Oasis HLB 固相萃取小柱（225 mg/Oasis HLB Plus Short cartridges，美國Waters公司）。

SAX陰離子交換小柱（360 mg/Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Short Cartridge，美國Waters公司）。

1.3? ? 樣品處理

顆粒狀的飼料研磨后過20目篩，準確稱取2.00 g置于50 mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖溶液20 mL（每1 000 mL緩沖溶液中含檸檬酸水合物12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g、Na2EDTA 37.2 g）。渦旋混勻1 min，搖床振蕩20 min，超聲波提取10 min，離心后收集上清液，殘留物重復提取1次后，合并2次上清液，混勻后取20 mL過SAX-HLB串聯小柱。上樣前，SAX-HLB串聯柱依次用5 mL甲醇、5 mL超純水和5 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液活化平衡;上樣時，將稀釋水樣流速控制在5～8 mL/min;上樣后，將上層SAX柱取下后用10 mL超純水淋洗 HLB 柱，負壓抽干后置于冷凍干燥機中干燥10 min;最后用6 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液并在40 ℃下用氮氣吹干，用流動相定容至1.0 mL。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 質量控制

四環素類采用外標法進行定量分析。以空白飼料為基質進行加標試驗，2.00 g飼料中分別加入10 ng和50 ng混合標準品，飼料中四環素類抗生素的回收率為23.5%～45.9%，其中土霉素的回收率最低、四環素回收率最高。回收率過低，無法滿足試驗要求。因此，本試驗中的標準曲線采用空白飼料樣品加標的方法制備，在2.00 g空白飼料中分別加入2、4、10、25、50、100 μL的混合標準儲備液（1 000 μg/L），與樣品同步處理。4種抗生素標準曲線R2在0.927 633～0.965 244之間，回收率為71.5%～129.4%（表2），滿足試驗要求。以S/N

≥3作為方法的最低檢出限，飼料中四環素類抗生素的檢出限為0.50～2.00 ng/g（圖2）。

2.2? ? 飼料樣品中抗生素殘留狀況

在采集的18個飼料中，檢測結果如表3所示，共有8個飼料樣品檢測出1～3種四環素類抗生素，檢出率為44.4%。4種抗生素中CTC的檢測率最高，為33.3%。其中，S5處青蝦養殖場的飼料中檢測出最高濃度，分別為CTC 2 580.00 ng/g、TC 546.00 ng/g、DOX 425.00 ng/g，遠遠高于其他7個飼料樣品中測出的濃度。由于在水產養殖中四環素類抗生素主要用于防治魚類的腸炎病、赤皮病等病害，如果人為在飼料中添加，一般添加量在10～100 mg/kg之間才會有治療效果[8]。本研究中S5處飼料測得的四環素類濃度為0.425～2.580 mg/kg，遠低于一般的添加量，因而可以認為飼料中的抗生素并非是養殖戶人為添加的。如果飼料中的抗生素并非是養殖戶人為添加，那么漁用飼料中的抗生素來源一般有2種，一是飼料加工廠的人為添加，二是養殖戶在養殖過程中因管理混亂所導致的污染。S5處飼料應該是屬于第2種情況。雖然理論上要求在水產養殖過程中飼料與魚藥要分開存放，但在實際的操作過程中，這一點很容易被養殖戶忽略，當飼料與魚藥同時存放在同一個儲藏間內，難免會發生一些交叉污染，從而在飼料中檢測出高濃度的抗生素殘留。

2.3? ? 不同水產養殖品種飼料中的抗生素殘留分析

在9個水產養殖品種中，有6個品種的飼料檢測出含有四環素類抗生素，其中泥鰍、青蝦的4個飼料中抗生素檢出率為100%。泥鰍作為一種高密度的養殖品種，屬于無鱗魚類，容易發生腐皮類的病害，四環素類抗生素在這方面有不錯的效果。青蝦作為湖州地區的特色產業，2018年的總產量占浙江省總產量的68%。由于青蝦的養殖密度低，養殖模式也比較簡單，很少發生病害，在養殖過程中一般不需要投放藥物。S5和S6這2份飼料中檢測出四環素類抗生素，S5是由于飼料被污染導致的，S6應該是在飼料的生產過程中加入的，至于原因，仍需要進一步調查。

從表4可以看出，外塘甲魚飼料中含有的四環素類抗生素最多，另外有3個品種中未測出抗生素，分別是溫室甲魚、青魚和烏鱧。有研究表明，在溫室甲魚的池塘水中可以檢測出多組分、高濃度的抗生素，其中就包含有四環素類抗生素[8]。本研究中的2個溫室甲魚飼料樣品中均未檢測出四環素類抗生素，一方面是因為檢測的飼料樣品批次過少;另一方面可能是因為在溫室甲魚的養殖過程中，主要預防肺炎和出血病，一般用的比較多的藥物是頭孢類和氧氟沙星，四環素類抗生素并非是主要用藥。青魚的養殖周期比較長，一般養殖密度也不會很大，所以養殖過程中病害相對較少，對于藥物的依賴性比較低。烏鱧是一個高密度的養殖品種，近些年以來，隨著對漁業環境的越發重視，導致地方一直在推廣投喂飼料的養殖模式，但這種模式卻始終有弊端，在養殖后期烏鱧的畸形率明顯高于投喂冰鮮的養殖模式。因此，有不少養殖戶仍然在延用以前投喂冰鮮的養殖模式或者是混合投喂的養殖模式（前期投喂飼料，后期投喂雞肝、鴨肝等冰鮮），所以烏鱧在養殖過程中對飼料的依賴性比較低，這可能是烏鱧飼料中抗生素濃度低的一個原因。

由此可見，飼料中的抗生素含量與水產品的養殖模式密切相關，包括投喂方式、病害情況、用藥習慣等。

3? ? 結論與討論

本研究采用超高效液相色譜串聯質譜法測定飼料中的四環素類抗生素，當以空白飼料為基質進行加標試驗時，4種四環素類抗生素的回收率均很低，無法滿足試驗要求。本研究最終采用在空白飼料樣品中加標的方法制備抗生素的標準曲線用于定量，4種四環素類抗生素的回收率可以達到71.5%～124.9%。

在采集的18個飼料中，共有8種飼料樣品中測出1～3 種四環素類抗生素，檢出率為44.4%。檢測出最高濃度分別為CTC（2 580 ng/g）、TC（546 ng/g）、DOX（425 ng/g）。這應該是養殖過程中管理混亂所導致的交叉污染現象。因此，在養殖過程中，應當加強管理，嚴禁將飼料與魚藥放在同一個儲藏間內。

不同飼料中的抗生素殘留差距較為明顯，飼料中的抗生素含量與水產品的養殖模式密切相關，包括投喂方式、病害情況、用藥習慣等。

4? ? 參考文獻

[1] 梁惜梅，施震，黃小平.珠江口典型水產養殖區抗生素的污染特征[J].生態環境學報，2013（2）：126-132.

[2] 李俊鎖，邱月明，王超，等.獸藥殘留分析[M].上海：上海科學技術出版社，2002.

[3] 周啟星，羅義，王美娥.抗生素的環境殘留、生態毒性及抗性基因污染[J].生態毒理學報，2007，2（3）：243-251.

[4] ZOU S，XU W，ZHANG R，et al.Occurrence and distribution of antibiot-ics in coastal water of the Bohai Bay，China：impacts of river discharge and aquaculture activities[J].Environmental Pollution，2011，159（10）：2913-2920.

[5] 劉葉新，周志洪，區暉，等.珠江廣州河段沉積物中典型抗生素的污染特征[J].華南師范大學學報（自然科學版），2018，50（4）：52-58.

[6] 張美金，林峰，林海丹，等.飼料中四環素類藥物含量的高效液相色譜測定[J].分析測試學報，2007（6）：918-920.

[7] 鄭衛東，胡丹，鄭海峰.數理統計技術在化學分析實驗室內部質量控制中的運用[J].食品安全質量檢測學報，2013（3）：950-953.

[8] 徐磊，孫博懌，盛鵬程，等.湖州地區典型水產養殖池塘中抗菌藥物的污染特征[J].江蘇農業科學，2019，47（11）：210-214.