木素脫氫聚合物-葡萄糖復合體形成機理的研究

謝益民 蔣 晨 劉雁超

（1.湖北工業大學制漿造紙研究院，湖北武漢，430068；2.湖北工業大學綠色輕工材料湖北省重點實驗室，湖北武漢，430068）

在制漿造紙工業、黏膠纖維工業[1-2]以及生物精煉過程中，需要最大限度從植物細胞壁中分離出纖維素，提高植物原料的利用率。大量研究[3-4]證實了植物體內木素與碳水化合物（纖維素和半纖維素）之間是有化學鍵連接的，主要與半纖維素間有大量的鍵結合，也有部分與纖維素連接，一般認為木素-碳水化合物復合體（LCC）之間的連接鍵為：苯甲醚鍵、糖醛酸苯甲酯鍵、苯基糖苷鍵、木素側鏈上的糖苷鍵和縮醛鍵等。而聚葡萄糖-木素復合體[5-8]的存在嚴重阻礙了制漿過程中木素的完全脫除，影響了紙漿的得率以及紙漿在深度脫木素過程中的效率[9-13]。因此聚葡萄糖-木素復合體中化學結構的解析及其降解特性的研究是制漿造紙領域和木材化學一個重要的研究方向。

20世紀90年代，Karlsson等人[5]利用色譜的方法確認了松木硫酸鹽漿里有非常牢固的木素-纖維素化學鍵。Isogai A[14]在研究高純度黏膠纖維時發現，反復的精制處理也不能獲得純的纖維素，通常伴隨著甘露糖、木糖等半纖維素組分，也含有木素組分，認為木素有可能與纖維素的C6之間存在化學鍵的連接。部分研究者[15-17]認為，比較無序的纖維素無定形區可能與木素有化學鍵的結合。Oinonen P 等人[18]的研究小組對纖維素-木素復合體做了大量的研究，認為纖維素微細纖維束及由木素和半纖維素構成的matrix 之間的界面上，存在木素側鏈Cα和纖維素之間的共價鍵的連接。Zhou Y 等人[19]使用天然豐度穩定同位素比值（18O/16O 比值）分析植物細胞壁纖維素和木素之間的化學鍵，提出了一個更詳細的纖維素-木素復合體模型，認為木素和纖維素之間存在γ-酯鍵和α-醚鍵的連接。也有研究者[20-21]提出纖維素和木素之間的連接鍵除了上述兩種外，還有可能存在苯基糖苷鍵。

為了更直觀研究纖維素和木素之間的化學連接，研究人員對植物體外合成木素-碳水化合物模型物進行了大量探索[22-23]。Freudenberg 等人[24-25]通過在濃厚的蔗糖溶液中滴加松柏醇及木素氧化酶，證實了松柏醇脫氫聚合反應中有木素-碳水化合物復合體形成的可能性。蘇琪等人[26]研究了在微晶纖維素存在下，木素脫氫聚合物-纖維素復合物（DHPCC）的生物合成，發現在二氯乙烷-乙醇混合液和8 mol/L 尿素溶液的溶解處理下，也不能完全去除DHP 部分，得出在木素脫氫聚合物形成的過程中能與纖維素產生牢固化學鍵連接的結果。顧瑞軍等人[27]合成了側鏈α位帶13C標記的木素前驅物松柏醇-β-D-葡萄糖苷，模擬木素生物合成過程，得到帶13C 標記的DHP-綜纖維素復合物（DHPHC），研究發現木素苯丙烷結構單元的Cα與碳水化合物間的化學連接鍵主要是醚鍵和酯鍵。總之，大量研究已經證實植物原料中碳水化合物和木素間存在化學鍵的連接，但是聚葡萄糖-木素間化學鍵的證據依然不足，仍需進一步探討。

本研究首先探討了在C6位帶13C 同位素標記的（6-13C）葡萄糖存在下，松柏醇葡萄糖苷利用過氧化物酶的催化作用，合成DHP-（6-13C）葡萄糖的聚合物，采用13C NMR 分析木素側鏈與葡萄糖C6位之間連接鍵的形成。在此基礎上，進一步分析在纖維二糖的存在下，松柏醇葡萄糖苷的過氧化物酶催化脫氫聚合，得到了DHP-纖維二糖復合體，通過13C NMR 分析纖維二糖與DHP 之間化學鍵的連接，從而進一步驗證聚葡萄糖與木素之間的連接方式。

1 實 驗

1.1 試劑及儀器

松柏醇-β-D-葡萄糖苷（實驗室合成）；葡萄糖氧化酶（15500 units/g，Ⅱ型，來自黑曲霉，購自美國Sigma 公司）；β-葡萄糖甙酶（6.3 U/mg,來自杏仁，購自美國Fluka 公司）；過氧化物酶（158 purpurogallin units/mg，Ⅱ型，來自辣根，購自美國Sigma 公司）；葡萄糖、乙酸鈉、乙酸、無水乙醚等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶液的配制：500 mg 松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶解在50 mL 的0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH值=4.9），適當的加熱溶解，冷卻并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，放置常溫備用。

Avance-400 傅里葉超導核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；K-16 大容量冷凍式離心機（美國Sigma 公司）；6700 型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR，美國Thermofisher Nicolet 公司）；DIF-6020 型真空干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）。

1.2 DHP-葡萄糖復合體的制備

采用顧瑞軍等人[27]改進的方法合成DHP-葡萄糖復合體，具體步驟為：將1.32 g 葡萄糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH 值=4.9）中，密封存放。在無菌條件下，將葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、過氧化物酶1.5 mg溶解在3 mL 新鮮的蒸餾水中，溶解好后加入到葡萄糖的緩沖溶液中。在曝氣條件下，用恒流泵將500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 內逐滴加入到酶與葡萄糖的混合溶液中，滴加完畢后，在30℃的恒溫水浴鍋中繼續反應10 天，且在反應期間不斷地通入經過棉花和活性炭過濾后的空氣。反應結束后離心分離，用水洗滌不溶物8次，真空干燥后再用無水乙醚清洗3次，真空干燥后得100.3 mg未標記的木素脫氫聚合物-葡萄糖復合物（DHP-葡萄糖復合體）。

取500 mg 松柏醇葡萄糖苷、100 mg (6-13C)葡萄糖，用上述方法合成96 mg 帶標記的復合物（DHP-(6-13C)葡萄糖復合體）。

1.3 DHP-纖維二糖復合體的制備

參考合成DHP-葡萄糖復合體的方法[27]，將2.5 g纖維二糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH 值=4.9）中。在無菌條件下，將葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、過氧化物酶1.5 mg 溶解在3 mL 新鮮的蒸餾水中，溶解好后加入到纖維二糖的緩沖溶液中。在曝氣條件下，用恒流泵將500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 內逐滴加入到酶與纖維二糖的混合溶液中，滴加完畢后，在30℃的恒溫水浴鍋中繼續反應10 天，且在反應期間不斷地通入經過棉花和活性炭過濾的空氣。反應結束后離心分離，用水洗滌不溶物8 次，真空干燥后得80 mg 木素脫氫聚合物-纖維素二糖復合物。

1.4 紅外光譜表征

取約2 mg 樣品與10 倍量的無水KBr 混合，混合均勻后，倒入壓片模具中壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀用透過法測定紅外光譜圖。

1.5 液態13C NMR譜圖的測定

液態13C NMR 譜圖采用華中科技大學的Bruker AV400 型核磁共振儀進行測定。將約100 mg 樣品溶于0.6 mL DMSO-d6中，用φ5 mm 樣品管。實驗條件：掃描頻率100 MHz，25℃，脈沖信號30°，延遲時間3 s，掃描次數20000次。

2 結果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 為DHP-葡萄糖復合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的紅外光譜圖。從圖1 可以看出，3427.3、3428.2 cm-1處的吸收峰為羥基的吸收峰。在1602.0、1510.4 cm-1及1413.3 cm-1處的吸收峰說明了該產物中有苯環結構存在[28]，由此可知產物中有木素結構。1035.8、1082.4 cm-1的吸收峰為葡萄糖結構上C—O鍵的伸縮振動[11]，說明聚合物中含有一定量的聚葡萄糖。由以上的分析可以推斷出葡萄糖與木素之間確實有化學鍵連接。要深入了解DHP 與葡萄糖之間具體的化學連接方式，還需要通過13C NMR 進行進一步分析。

圖1 DHP-葡萄糖復合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的FT-IR圖

2.2 高分辨率液態13C NMR分析

圖2 DHP-葡萄糖復合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的13C NMR譜圖

圖2 為DHP-葡萄糖復合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的13C NMR 譜圖。根據前人對木素的13C NMR譜圖的分析結果[29-32]，本研究對圖2 中的共振信號進行了歸屬，結果見表1。分析得到的木素結構單元間連接方式如圖3 所示。以δ=56.04 處甲氧基的共振峰作為基準，由分析可知δ為176.65 (No.1)、174.89(No.2)處均為阿魏酸及其衍生物的羰基的共振信號(結構見圖3(Ⅰ)、圖3(Ⅱ))。δ=147.58(No.3)是醚化的愈創木基中的C3，δ=144.12 (No.5)處是醚化的5-5’結構(見圖3(Ⅳ))中的C4/C4’，δ=132.26(No.6)處為愈創木基中的C1，δ為129.70(No.8)和128.44(No.9)處均為松柏醇結構中的Cα和Cβ(見圖3(Ⅰ))上的振動信號，δ為119.40(No.10)～110.22(No.12)處分別為愈創木基中C6、C5、C2上的振動峰，上述吸收峰的強度都比較高，說明了DHP-葡萄糖復合體中芳香族結構所占的比例比較高。δ為100.34 (No.13)處為葡萄糖上的C1的振動峰，δ為87.53 (No.15)處的信號峰為β-5 結構(見圖3(Ⅵ))中的Cα和Cβ的共振吸收峰。δ為85.50(No.16)處是β-β結構(見圖3(Ⅶ))中Cα的吸收峰。δ為71.12 (No.21)處是葡萄糖上C2的振動峰，δ為73.58(No.18)處為葡萄糖上C3的振動吸收峰，δ為70.17(No.22)處為葡萄糖上C4的振動峰，δ為71.91(No.20)處為葡萄糖上C5的振動峰，δ為61.99(No.24)處為葡萄糖C6的峰，DHP-(6-13C)葡萄糖復合體較DHP-葡萄糖復合體有很明顯的增強，說明復合體中的葡萄糖C6被13C 同位素標記，此處還有愈創木基β-O-4 結構(見圖3(Ⅲ))中Cγ的峰。δ為72.70 (No.19)處的吸收峰，兩種復合體譜圖相比較可發現DHP-(6-13C) 葡萄糖復合體峰有明顯的增強。根據Azuma J 等人[33]對纖維素及其相關碳水化合物的核磁研究表明纖維素C6位上的碳有醚鍵存在時，纖維素C6峰的化學位移向低場遷移到δ為72.6。根據Xie Y 等人[34]的研究結果，木質素苯丙烷結構上只有Cα上才有醚鍵型LCC 連接鍵的存在，由此可知，δ為72.70處的峰為與β-O-4結構中Cα有醚鍵連接的纖維素C6位上的碳原子的共振信號。該結果與向松明等人[22-23]對銀杏中的纖維素的13C同位素示蹤所得到的結果一致(見圖3(Ⅴ))。

表1 DHP-葡萄糖復合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的13C NMR 分析

由DHP 和葡萄糖的過氧化物酶催化聚合實驗以及13C NMR的結果分析可知，DHP-葡萄糖復合體中存在的木素結構包括β-β、β-O-4 和β-5，同時還包含少部分的阿魏酸結構。通過帶13C 標記的葡萄糖與DHP聚合，得到的聚合物DHP-(6-13C)葡萄糖復合體的13C NMR 與不帶同位素標記的DHP-葡萄糖復合體對比分析可知，葡萄糖C6上的碳與木素結構是以苯甲醚鍵連接的。

2.3 纖維二糖存在下DHP 的生物合成產物紅外光譜分析

纖維二糖存在下DHP 的生物合成產物（DHP-纖維二糖）的FT-IR 譜圖如圖4 所示。可以看出3442.63 cm-1為羥基的伸縮振動峰，2892.71 cm-1為甲基、亞甲基及次甲基中C—H 鍵的伸縮振動，1652.92 cm-1為共軛羰基的伸縮振動，1515.75 及1438.35 cm-1處的吸收峰說明了該產物中有苯環結構存在，由此可知產物中有木素結構存在。1459.17 cm-1為甲基中C—H 鍵的伸縮振動峰，1384.91 cm-1為芳香核（—OH）振動，1269.24 cm-1為羥基振動和木素中C=O 伸縮振動，1142.48 cm-1為纖維素中羥基的締合光帶，1033.95 cm-1為纖維素中C—O 的伸縮振動，說明有纖維素的存在，至于纖維二糖與木素具體的化學鍵連接方式，還需要用高分辨率的液態核磁來對產物進行檢測分析。

2.4 DHP-纖維二糖復合體的13C NMR波譜分析

為了進一步驗證植物體內纖維素C6位與木素側鏈Cα之間的醚鍵連接[22-23]，本實驗采用DHP 與纖維二糖聚合形成DHP-纖維二糖復合體，其13C NMR 如圖5所示，具體的核磁共振信號的分析結果見表2。δ為194.82(No.1)為松柏醛結構中的γ-CHO 的共振吸收峰，δ為172.54No.2)是DHP里阿魏酸的Cγ的振動峰，δ為149.84(No.3)、148.02(No.4)為愈創木基結構中碳的吸收峰，δ為144.15 (No.5)是醚化了的5-5 結構中C4的吸收峰。δ為132.81(No.6)是愈創木基結構中與丙烷結構相連接的C1的共振信號。δ為129.50(No.7)和128.48(No.8)分別為松柏醇結構中的Cα和Cβ上的振動信號，δ為119.09(No.9)～110.89(No.11)分別為愈創木基中C6、C5、C2上的振動峰，上述吸收峰的強度均比較高，說明了DHP-纖維二糖復合體中有大量的芳香族結構存在。δ為100.82(No.12)處的信號峰是纖維二糖C1的峰，δ為87.69(No.13)處的信號峰為β-5 結構中的Cα共振峰。δ為85.68(No.14)是β-O-4中 的Cβ以及β-β結構中Cα的信號，δ為81.55(No.14’)處微弱的信號來自于木素結構單元與糖類有苯甲醚鍵相連接的Cα[34-35]。δ為72.11～74.56(No.16)的信號歸屬如下：與纖維二糖上的C2以及與纖維二糖有苯甲酯鍵連接的木素結構單元的]，與β-O-4 結構中Cα有醚鍵連接的纖維素6 位上的碳原子的共振信號[22-23]，以及β-O-4 中Cα，纖維二糖上的C2的信號。δ為70.13(No.17)為纖維二糖上的C4的信號峰。δ為63.43（No.18）處的信號來自苯基香豆滿的Cγ，β-1 結構中Cα與Cβ。δ為62.12(No.19)處除了有纖維二糖上C6的振動峰以外，還有β-O-4 結構中Cγ的共振吸收峰。

圖3 DHP-葡萄糖復合體中愈創木基的結構單元及與葡萄糖的連接

圖4 DHP-纖維二糖復合體的FT-IR譜圖

圖5 DHP-纖維二糖復合體的13C NMR譜圖

由以上的分析結果可以知道，DHP-纖維二糖復合體中木素的結構單元之間主要有β-β、β-O-4、β-5以及β-1 等連接方式。DHP 與纖維二糖之間存在苯甲醚鍵、苯甲酯鍵和縮醛鍵相連接，至于具體的纖維二糖上的哪個碳原子與DHP 的哪個碳原子以何種方式連接，還需要進一步采用同位素示蹤等方法闡明。

表2 DHP-纖維二糖復合體的13C NMR分析

3 結論

本研究分別在葡萄糖和C6位帶13C同位素（6-13C）葡萄糖的存在下，以松柏醇葡萄糖苷為木素前驅物，采用木素過氧化物酶催化脫氫聚合的方法，分別形成了木素脫氫聚合物-葡萄糖和木素脫氫聚合物-(6-13C)葡萄糖的聚合物，研究了木素脫氫聚合物（DHP）與葡萄糖的化學鍵連接方式。

3.1 通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振碳譜（13C NMR）分析及DHP-葡萄糖和DHP-(6-13C)葡萄糖的波譜圖對比可知，葡萄糖上的C6與木素結構以苯甲醚鍵連接。

3.2 在纖維二糖的存在下，以松柏醇葡萄糖苷為木素前驅物，采用生物法合成脫氫聚合物的過程中，木素前驅物與纖維二糖之間發生了共聚，得到了DHP-纖維二糖的復合體，通過FT-IR 以及13C NMR 分析結果得知，纖維二糖與DHP 之間有化學鍵的連接，可能通過苯甲醚鍵、苯甲酯鍵和α-縮醛鍵相連接。