紅景天苷通過bFGF、VEGF抵抗成骨細胞凋亡的研究

夏永嚴

骨質疏松癥是臨床上常見的骨科疾病之一，以骨量減少和骨微結構的破壞為主要特征，具有較高的全身性骨折風險，且隨著社會老齡化和人們生活飲食的改變，其發病率逐年增加，嚴重影響患者的身體健康[1,2]。有研究報道，血管新生在骨形成過程中具有重要的作用，可為成骨細胞形成新骨提供充足的血供，其中堿性成纖維細胞因子(bFGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)是刺激血管新生的重要因子[3,4]。而紅景天苷是一種由紅景天提純制成的中藥成分，具有活血化瘀、通脈止痛之功效，有助于改善血液循環及促進血管新生[5]，但關于其對成骨細胞凋亡的作用筆者能找到的報道較少。對此，本研究通過給予MG-63人成骨細胞進行紅景天苷培養，并檢測其bFGF、VEGF表達情況，以深入了解紅景天苷抵抗成骨細胞凋亡的作用機制，為臨床防治骨質疏松癥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 MG-63人成骨細胞(美國 ATCC公司生產，武漢大學中國典型培養物保藏中心提供)，紅景天苷(A0076)購自中國藥品生物制品檢定所，DMEM培養基(中國上海GIBICO公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京Solarbio公司)，二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Sigma公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，鼠抗人bFGF、VEGF抗體(上海聯世生物科技有限公司)，茜素紅、硝酸銀染色顯色試劑盒(美國Pierce公司)，成骨誘導分化培養基試劑盒(賽業生物科技有限公司)，其余試劑均購自(上海貝博有限公司)；680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)，顯微鏡和共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，核酸蛋白測定儀和化學發光凝膠成像儀(美國GE公司)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，其余設備均購自蘇州凈化設備廠。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞的培養：將復蘇后的MG-63人成骨細胞置入質量濃度為100 g/L的胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%的CO2的培養箱中培養1～3 d、隔天換液，顯微鏡下觀察細胞生長狀態和密度，選擇生長狀態良好和密度>85%時的細胞進行傳代培養后，換含10 g/L的FBS、DMEM放入孵育箱培養1 d以使細胞同步化。

1.2.2 成骨細胞的細胞增殖實驗(MTT)：取對數生長期MG-63人成骨細胞接種于96孔板，調整細胞濃度為5×104個/孔、PBS為200 μl/孔、設6個復孔，在37℃、5%的CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后，依據隨機數字表分為紅景組和對照組，每組48孔，對照組給予常規培養3 d，紅景組在對照組基礎上給予100 nmol/L紅景天苷培養3 d，并于培養當日和培養1、3 d后每孔加10 μl濃度為5 g/L的MTT孵育4 h，每孔加100 μl的DMSO，震蕩10 min，酶標儀檢測492 nm波長吸光度(MTT值)，測3次并取平均值。

1.2.3 bFGF、VEGF的Western blot(WB)法檢測：于培養當日和培養1、3 d提取細胞總蛋白、檢測蛋白濃度后，定量、加上樣緩沖液99℃變性10 min，蛋白上樣后，電泳、轉硝酸纖維素膜，50 g/L的脫脂牛奶封閉 2 h 后，設β-actin對照組，分別加1∶1 000的bFGF和1∶20 000的GAPDH一抗，4℃過夜雜交后，洗膜、加入二抗室溫雜交1 h，洗膜后加入顯影液顯影，測3次并取平均值，以相同方法檢測VEGF表達水平。

1.2.4 成骨細胞的骨化結節染色實驗：于培養當日和培養1、3 d取MG-63人成骨細胞經0.25%胰蛋白酶消化并培養至第三代后，以細胞數2.5×105個/孔接種于96孔板中，待細胞鋪至孔底>70%時加入100 μl的30 μmol/L成骨細胞誘導液培養3 d，吸去培養液、PBS清洗2次、4%多聚甲醛固定30 min后，行茜素紅和硝酸銀染色，并觀察骨化結節情況。

2 結果

2.1 2組bFGF、VEGF的WB值比較 2組培養當日bFGF、VEGF的WB值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；紅景組培養1、3 d bFGF、VEGF的WB值明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、2,圖1、2。

組別培養當日培養1 d培養3 d對照組0.42±0.050.46±0.070.48±0.07紅景組0.43±0.060.57±0.100.64±0.11t值0.8876.2438.502P值0.377<0.001<0.001

組別培養當日培養1 d培養3 d對照組0.51±0.070.53±0.090.54±0.09紅景組0.50±0.070.62±0.100.71±0.11t值0.7004.6358.287P值0.486<0.001<0.001

AB

圖1對照組bFGF的WB：A為bFGF，從左至右分別為培養當日和培養1、3 d；B為VEGF，從左至右分別為培養當日和培養1、3 d

AB

圖2紅景組VEGF的WB：A為bFGF，從左至右分別為培養當日和培養1、3 d；B為VEGF，從左至右分別為培養當日和培養1、3 d

2.2 2組MTT值(A492)比較 2組培養當日MTT值(A492)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；紅景組培養1、3 d后MTT值(A492)明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3,圖3、4。

組別培養當日培養1 d培養3 d對照組0.661±0.0720.705±0.0830.817±0.087紅景組0.654±0.0740.961±0.0981.302±0.134t值0.47013.81121.032P值0.639<0.001<0.001

ABC

圖3對照組MTT觀察(顯微鏡×100)；A為培養當日，B為培養1 d，C為培養3 d

2.3 2組骨化結節數比較 2組培養當日骨化結節數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；紅景組組培養1、3 d骨化結節數明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4,圖5、6。

ABC

圖4紅景組MTT觀察(顯微鏡×100)；A為培養當日，B為培養1 d，C為培養3 d

表4 2組骨化結節數比較 n=48,個/孔,

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圖5對照組成骨細胞的骨化結節染色實驗(茜素紅和硝酸銀染色大體觀察)：A為培養當日，B為培養1 d，C為培養3 d

ABC

圖6紅景組成骨細胞的骨化結節染色實驗(茜素紅和硝酸銀染色大體觀察)：A為培養當日，B為培養1 d，C為培養3 d

3 討論

骨質疏松癥是一種由多原因引起骨密度和骨質量下降的骨病，可導致骨微結構損害和骨脆性增加，主要表現有腰背痛、駝背、脆性骨折等癥狀，嚴重影響患者的生活質量[1,2]。而大量研究證實，骨骼的正常生長是由成骨細胞與破骨細胞的細胞功能共同維持的骨代謝動態平衡所決定，當機體出現骨質疏松癥時，會使成骨細胞凋亡增加、破骨細胞凋亡減少，導致骨形成平衡破壞而使骨化減弱，導致骨微結構損害和骨密度、骨質量下降，最終導致骨折的發生[6,7]。

有研究顯示，血供不足所致缺血缺氧在骨質疏松癥骨形成減少中具有重要的作用，尤其是毛細血管數量及血流減少，可使成骨細胞處于低血供低氧狀態而加快其凋亡，從而引起骨代謝的變化，導致骨生成減少、骨量丟失[8,9]。而紅景天苷是一種具有活血化瘀、通脈止痛功效的中藥成分，具有抗缺氧、促血管新生、改善血供等多種藥理作用[10,11]。近年來，相關研究報道，紅景天苷被逐漸應用于多種骨病的治療中，有助于促進骨形成而受到關注和重視，但關于其對成骨細胞凋亡的作用機制尚未明確[5]。

此外，bFGF是一種能夠促進成纖維細胞生長的物質，對成纖維細胞、骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞等具有強效的促細胞分裂增殖活性作用，可參與血管形成、組織修復再生和神經組織生長發育等[12,13]。而VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，可促進血管內皮細胞生長及誘導血管新生，在血管形成中具有強效的促進作用[14]。

本研究結果顯示，紅景組培養1、3 d bFGF、VEGF的WB值明顯高于對照組，紅景組培養1、3 d MTT值(A492)明顯高于對照組，表明紅景天苷可能通過上調bFGF、VEGF表達來抵抗MG-63人成骨細胞的凋亡。這可能是由于bFGF、VEGF與骨的形成與修復密切相關，其表達水平直接影響到成骨細胞的血供、形成速度與骨化質量。而在本研究給予MG-63人成骨細胞進行紅景天苷培養中，紅景天苷抗缺氧、促血管新生、改善血供等多種藥理作用，能夠刺激了多種細胞因子的合成分泌，尤其是可能上調了bFGF、VEGF表達，通過VEGF能夠誘導血管新生而改善成骨細胞的供血供氧狀態，從而對成骨細胞產生保護的作用；而通過bFGF能夠促進予MG-63人成骨細胞的細胞分裂增殖活性而抵抗其凋亡，并能夠進一步促進VEGF的合成而有效促進血管內皮細胞增殖及血管形成，從而有效促進了成骨細胞的增殖、減少了成骨細胞的凋亡。此外，本研究中，紅景組組培養1、3 d骨化結節數明顯高于對照組，表明紅景天苷能夠有效改善MG-63人成骨細胞的骨化活性。這可能是由于本研究紅景天苷培養中，其具有活血化瘀、通脈止痛之功效，能夠有效上調bFGF、VEGF等細胞因子的表達，有助于誘導血管新生而改善了成骨細胞的供血供氧狀態，從而對成骨細胞具有保護作用，使成骨細胞的凋亡減少，并有助于成骨細胞的分化成熟，調節了骨代謝動態平衡而促進了骨形成，并最終骨化形成了骨結節組織。

綜上所述，紅景天苷可能通過上調bFGF、VEGF表達來抵抗MG-63人成骨細胞的凋亡，有助于改善MG-63人成骨細胞的骨化活性，這為全面深入闡明紅景天苷促進骨生成的作用機制奠定基礎，應能夠為紅景天苷防治骨質疏松癥提供依據。