正五聚蛋白3和肝素結合蛋白在肺結核診斷中的價值

邢志偉 高艷軍 張聰瑤 朱梅玲 張建武

結核病是最常見并可致命的一種傳染病，盡管目前全球在醫療技術方面取得了新進展，但結核病仍然是公共衛生方面的一項重要挑戰[1]。世界衛生組織報告2016年新增結核病1 100萬例，死亡140萬例[2]。由于結核病診斷方法的局限性，所以缺乏最佳診斷方法，臨床醫生仍然面臨著早期診斷的困惑[3]。結核病的早期檢測在控制疾病和防止感染蔓延方面具有重要作用。正五聚蛋白(pentraxin，PTX)3屬于機體免疫系統保守的多聚體蛋白超家族，它的成員包括短五聚體蛋白和長五聚體蛋白。所有這些蛋白質在先天免疫中起著關鍵作用，通常被認為是急性期免疫蛋白，它們對機體的調節作用有多種，如炎癥、血管生成、腫瘤生成、細胞粘附等[4]。相關文獻表明，PTX3在先天性病原體抵抗和炎癥調節中發揮了重要作用[5]， PTX3也是一種重要的血清學標志物，包括心血管疾病、敗血癥和癌癥在內的多種臨床炎癥和感染條件下，能迅速反映局部組織的炎癥和損傷[6]。肝素結合蛋白(heparin binding protein，HBP)儲存在中性粒細胞的分泌顆粒和嗜苯胺藍顆粒中，在細胞激活時釋放。HBP是一種多功能促炎介質，例如激活免疫細胞，具有廣泛的抗菌活性，并誘導血管滲漏。血漿HBP被認為是一種評價嚴重膿毒癥和膿毒性休克進展的預測因子[7]。細菌性腦膜炎[8]時腦脊液和尿路感染[9]時尿液中的HBP水平也升高，這表明HBP可作為指示細菌感染的生物標記物。最近，HBP被認為是支氣管肺泡灌洗液中檢測肺移植受者肺部感染的重要生物標記物[10]。本研究測定活動性肺結核患者，潛伏性結核感染者以及健康對照者外周血中PTX3和HBP的表達水平，探討它們對肺結核診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 (1)肺結核組：收集2017年3～12月在我院結核科住院的初治肺結核患者125例，其中男77例，女48例；年齡21～63歲，平均年齡(40.2±11.7)歲。肺結核診斷參照中華人民共和國衛生行業標準(WS288-2017)，以病原學實驗室檢查為主，結合胸部影像學、流行病學和臨床表現，以及其他相關輔助檢查和鑒別診斷進行綜合分析作出的診斷。肺結核患者根據影像學診斷，分為肺部有空洞組31例，無空洞組94例；肺結核患者給予標準化治療2HRZE/4HR抗結核方案治療6個月。(2)潛伏感染組：收集同期潛伏性結核感染109例，其中男51例，女58例；年齡22～65歲，平均年齡(41.3±13.6)歲。細菌學檢測即痰涂片及培養確定陰性，而PPD試驗陽性，有結核病接觸史，結合臨床癥狀及影像學表現無肺結核特征。(3)對照組：來自同期進行體檢的健康者112例，其中男65例，女47例；年齡26～60歲，平均年齡(38.9±10.5)歲。3組間年齡和性別比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象排除糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病等，且均無合并其他傳染性疾病如病毒性肝炎、HIV等感染，均為漢族。本研究經醫院倫理委員會批準，收集標本已和所有患者及志愿者簽署書面知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 (1)總RNA提取試劑Trizol LS購自Invitrogen公司。(2)聚合酶鏈(PCR)反應體系購自寶生物工程(大連)有限公司。(3)PCR上下游引物購自英濰捷基(上海)貿易有限公司。(4)PCR擴增儀(LightCycler 480Ⅱ，Roche公司)；人HBP的ELISA試劑盒(杭州中翰盛泰生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本收集：研究對象空腹采集靜脈血，收集在EDTA抗凝管， 3 000 r/min離心10 min，分離的血漿可置于-80℃保存。肺結核組標本收集在抗結核治療前、抗結核治療3個月及6個月后采血。

1.3.2 總RNA提取：向分離所得的部分血漿中加入Trizol LS試劑，體積比為1∶3，操作步驟按說明書進行提取總RNA，最后室溫干燥RNA沉淀，加入無RNase的水溶解RNA，放-80℃保存備用。

1.3.3 RT-PCR實驗檢測PTX3的mRNA水平：RNA提取后首先反轉錄合成cDNA，嚴格按試劑盒說明書提供的步驟進行操作。以反應產物cDNA為模板進行PCR擴增，體系包括1 μl cDNA模板，2 μl的10倍PCR緩沖液(含Mg2+)，0.3 μl的TaqDNA聚合酶(5 U/μl)，0.5 μl dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物各0.5 μl(10 mmol/L)。PTX3的上游引物是 5’-CGTTT

GCGGTTAGGAGTATTC-3’ 和下游引物5’- CAAAACG

TCGTCCGTAACTTA -3’,擴增片段長度為103 bp， GAPDH上游引物5’- GACCACTTTGTCAAGCTCATTT

CC-3’，下游引物5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCC- TCTTGT- 3’,擴增片段長度為323 bp。PCR擴增條件包括95℃預變性10 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環后72℃延伸10 min。取擴增產物，直接加樣于1.2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，80V電壓，電泳30 min，用凝膠成像系統拍攝分析各電泳條帶，mRNA表達相對值等于目的片段光密度值/GAPDH光密度值。

1.3.4 ELISA實驗檢測HBP的表達：操作按試劑盒說明書進行，根據酶標儀的吸光度換算HBP的含量。

2 結果

2.1 3組PTX3和HBP的表達 采用RT-PCR檢測3組PTX3的mRNA表達，潛伏感染組的表達較對照組差異無統計學意義(P>0.05)，肺結核組PTX3的表達較潛伏感染組和對照組表達均明顯升高(P<0.01)；采用ELISA檢測3組HBP，顯示肺結核組較潛伏感染組和對照組表達均有顯著升高(P<0.01)。見表1。

組別PTX3 (mRNA)HBP(ng/ml) 對照組(n=112) 0.83±0.31?15.06±2.94?潛伏感染組(n=109)0.93±0.33?16.28±4.49?肺結核組(n=125) 2.18±0.9924.90±6.02F值142.15155.66P值0.0000.000

注：與肺結核組比較，*P<0.05

2.2 PTX3和HBP的表達與肺結核患者肺部空洞的關系 肺結核患者中有空洞組中PTX3和HBP的表達均顯著高于無空洞組，差異有統計學意義 (P<0.01)。見表2。

組別PTX3(mRNA)HBP(ng/ml)有空洞組(n=31)3.27±0.7631.65±3.77無空洞組(n=94)1.82±0.7822.70±4.84t值9.069.41P值0.0000.000

2.3 肺結核患者治療前后PTX3和HBP表達比較 所有初治肺結核患者均接受規范化抗結核治療3個月及6個月，與治療前相比，治療 3 個月和6 個月PTX3和HBP表達水平均顯著下降，所有患者抗結核治療效果良好；且接受治療6個月組與接受治療3個月組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

時間PTX3(mRNA)HBP (ng/ml)治療前 2.18±0.9924.90±6.02治療3個月1.29±0.45?18.93±4.91?治療6個月0.98±0.25?#16.95±4.38?#F值 115.9680.71P值0.0000.000

注：與治療前比較，*P<0.05；與治療3個月比較，#P<0.05

2.4 受試者工作曲線(ROC)評估PTX3和HBP的診斷效能 繪制肺結核組的ROC曲線，PTX3和HBP有較好的診斷價值：AUC 顯示為0.855和0.849，以1.47為臨界值，PTX3鑒別肺結核患者的敏感度和特異度分別為 72.8%和87.9%；以 18.68 ng/ml為臨界值，HBP鑒別肺結核患者的敏感度和特異度分別為82.4%和71.9%。見圖1。

3 討論

五聚體蛋白是一個發育保守的多聚體蛋白超家族，其特征是在其羧基末端存在一個保守的8個氨基酸長序列。根據其N端氨基酸的長度主要分為短五肽和長五肽，短五肽和長五肽具有不同的蛋白質大小，在不同的基因啟動子的影響下由不同的基因合成。PTX3是一種多功能蛋白，具有多聚體結構和保守域，與其他長五聚蛋白一樣，PTX3蛋白包含一個獨特的N末端區域和一個與短戊聚糖同源的C末端區域，可由多種炎癥相關刺激誘導。PTX3是一種急性期反應物，對原發性促炎信號和微生物識別反應迅速產生，PTX3作為一種可溶性模式識別受體，可與多種病原體/損傷相關分子模式結合，在先天免疫系統中起著重要作用，可作為一種激活經典補體途徑的調理素[11,12]。

圖1 PTX3和HBP診斷肺結核的ROC曲線

它的多重作用可以被認為是位點特異性的，因為它的產生發生在多種細胞類型中，包括內皮細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、肝細胞和單核細胞等。PTX3與多種免疫相關性疾病有密切關系，發揮多種生物學反應，參與機體的免疫防御、炎性反應、血管重塑等。有實驗表明急慢性炎癥疾病中外周血 PTX3 水平迅速增加，且存在時間持久[13]。PTX3對病原體的識別等方面有重要的調節作用，是宿主防御某些感染的關鍵成分，在膿毒癥患者血清中，PTX3濃度明顯高于對照組，PTX3水平與膿毒癥嚴重程度相關，可以有助于膿毒癥病情預測以及膿毒癥和膿毒性休克的鑒別診斷[14]。Azzurri等[15]探討了PTX3在感染疾病中作為生物標記物的作用，新診斷的結核病患者中PTX3水平高于健康家庭對照和社區對照，在治療方案結束時，受試者對治療反應顯著降低了PTX3水平，而治療失敗的患者，PTX3水平進一步升高，表明該蛋白的檢測可能有助于監測疾病活動和治療效果。

HBP是新近被發現的炎癥標志物之一，HBP一旦釋放，表現出強烈的促炎活性。在感染部位，HBP的化學作用是吸引和激活更多的中性粒細胞，也包括T淋巴細胞和單核細胞。HBP與單核細胞β2整合素結合，啟動細胞內信號傳導過程，引起趨化因子和促炎介質的釋放。HBP通過促進巨噬細胞對病原體的識別和吸收，有助于抗菌藥物的清除。此外，HBP通過與管腔細胞表面糖胺聚糖相互作用以及激活蛋白激酶C和Rho激酶途徑，激活內皮細胞并增加內皮通透性。HBP已被證明是疑似敗血癥的一個有價值的診斷標志物[16]，在嚴重的敗血癥患者中顯示出良好的預后和鑒別特性[17]。實驗和臨床證據支持該蛋白在膿毒癥引起的器官功能障礙的病理生理學中發揮重要作用[18]。最近研究也表明HBP水平的升高與危重患者的循環衰竭、腎衰竭和死亡率有關[19]。有文獻顯示胸腔積液HBP水平診斷效能高，能較好區分胸腔積液患者的肺炎旁胸腔積液，可能是肺炎旁胸腔積液鑒別診斷的生物標志物[20]。

PTX3和HBP帶來的多重影響現在越來越受到關注。研究結果顯示肺結核組外周血PTX3和HBP水平顯著高于潛伏感染組和對照組(P<0.05)，提示在活動性肺結核患者中PTX3和HBP表達升高，但潛伏感染組和對照組PTX3和HBP的結果無統計學差異。根據不同臨床表型進行分組分析，結果提示肺部有空洞結核患者 PTX3和HBP水平高于無空洞患者， PTX3和HBP的水平與臨床表現的嚴重程度顯著相關。PTX3和HBP在肺結核發病中發揮重要作用，我們發現它們的表達變化與疾病的進展有關，可能影響宿主對于結核分枝桿菌的免疫應答?；顒有苑谓Y核患者接受標準抗結核治療，且患者抗結核治療效果良好。本研究對患者隨訪6個月，發現與治療前相比，在抗結核治療3個月后PTX3和HBP水平明顯下降，且隨著治療時間延長，PTX3和HBP表達量逐漸降低。當接受6個月抗結核治療后， 隨訪患者的PTX3和HBP已下降至正常水平，與對照組比較無統計學差異。

本研究應用ROC曲線分析PTX3和HBP的診斷效能以及鑒別肺結核患者的敏感度和特異度。ROC曲線是以1-特異度為橫坐標，靈敏度為縱坐標，并可用曲線下面積反映實驗診斷的價值大小。對肺結核組繪制ROC曲線，結果顯示PTX3和HBP具有較高的敏感度和特異度。提示PTX3和HBP對活動性肺結核診斷有一定的優勢，對病情的評估有指導作用，可能是區別活動性和潛伏性結核感染的較敏感指標。

綜上所述，本實驗研究PTX3和HBP的表達變化，可作為輔助診斷肺結核病的主要依據之一，有望成為MTB感染期間炎癥和疾病活動的重要生物標志物，使我們更加深入地了解結核分枝桿菌的發病機制，為今后結核病的早期治療及改善結核病的結局，發揮重要的臨床應用價值。因為PTX3和HBP水平可能受到復雜的過程和途徑中多種因素影響，包括細胞因子、趨化因子、生長因子和特定的啟動子基因[21]，所以根據具體情況，制定適合各種疾病的血漿PTX3和HBP檢測目標，更好的解釋疾病的發病機制、診斷或預后。