miR-181a和GATA6在妊娠滋養細胞疾病中的表達及臨床意義

張麗華

妊娠滋養細胞疾病(gestational trophoblastic disease,GTD)是一系列源于妊娠物而非患者本身的疾病，因攜帶父源基因而與其他腫瘤不同[1]。GTD主要包括葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、妊娠滋養細胞瘤[2]。葡萄胎屬于良性病變，但與腫瘤有著極為相似的侵襲和遠處轉移的生物學特征，約有4%的部分性葡萄胎和20%的完全性葡萄胎會進展為妊娠滋養細胞瘤[3]。妊娠滋養細胞瘤具有較強的局部浸潤、破壞和侵入血管的能力，易發生早期廣泛遠處轉移，尤其是顱腦轉移引發復雜并發癥，導致患者死亡[4]。微小RNA在腫瘤侵襲轉移中發揮重要作用，有研究表明，miR-181a通過靶向ABI1影響神經母細胞瘤細胞的生長、侵襲和轉移[5]，但miR-181a與妊娠滋養細胞疾病關系尚不清楚。GATA結合蛋白6(GATA binding protein 6,GATA6是一種保守的轉錄調節因子，在多種腫瘤疾病中異常表達，參與多種腫瘤的發生發展過程[6]。但GATA6在妊娠滋養細胞疾病中的研究筆者尚未見報道。本研究探討miR-181a、GATA6在妊娠滋養細胞疾病中的意義，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年2月至2017年3月于我院就診的妊娠滋養細胞疾病患者80例為研究對象，其中未發生惡變葡萄胎患者45例，年齡21～45歲，平均年齡(25.12±5.23)歲；妊娠滋養細胞瘤患者35例，年齡23～49歲，平均年齡(26.43±6.27)歲；Ⅰ期妊娠滋養細胞瘤9例，Ⅱ期妊娠滋養細胞瘤11例，Ⅲ期妊娠滋養細胞瘤15例。另選取同期因個人因素或社會因素行人工流產手術的正常早孕者40例為對照組，年齡21～46歲，平均年齡(25.87±5.19)歲。3組受試者年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①研究組患者均經B超、影像學、病理學診斷確診為妊娠滋養細胞疾病患者；②對照組正常早孕者均無異常妊娠史，且均確診為孕8～12周正常妊娠。③受試者及家屬對本研究內容完全知情，并自愿簽署知情同意書；④所有入選者臨床資料完整。

1.2.2 排除標準：①已接受過藥物治療或手術治療者；②合并其他惡性腫瘤者；③依從性差，無法配合完成研究者；④臨床資料不全者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：妊娠滋養細胞瘤組織標本取自手術切除子宮標本，葡萄胎標本取自患者首次清宮時，對照組正常早孕絨毛組織取自正常早孕行人工流產手術者，所有組織采集后以0.9%氯化鈉溶液吸凈，一部分放入液氮中速凍5 min后置于-80℃保存備用，另一部分以10%甲醛溶液固定，用于免疫組化實驗。

1.3.2 miR-181a、GATA6 mRNA表達水平檢測：采用RNAfast 200提取試劑盒(上海飛捷生物科技有限公司)提取組織中總RNA?？俁NA提取后以1.0%瓊脂糖電泳檢測其純度及完整性。取2 μg純凈無降解RNA，以Prime Script TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)反轉錄為cDNA，熒光定量PCR反應體系及實驗操作參照SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明書進行，每個樣本設置3個重復，反應體系加配完成后，置于CFX95熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)反應。反應程序結束后收集實驗數據，miR-181a以U6為內參基因，GATA6以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt計算受試者組織中miR-181a和GATA6 mRNA相對表達水平。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組化：所有組織經10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚度切片。每個樣本分別做蘇木精-伊紅染色法和免疫組化EnVi-son兩步法染色，DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察。由高年資病理醫師根據免疫組化染色結果，隨機取5個高倍視野進行結果判定，以細胞核出現黃色至棕褐色顆粒為陽性顯色，無著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色3分，陽性細胞密度分級為陽性細胞數<10%記1分，10%～50%記2分，>50%記3分，兩項評分乘積結果>3分為陽性。

2 結果

2.1 3組受試者miR-181a、GATA6 mRNA表達水平比較 3組受試者組織中miR-181a、GATA6 mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.05)。妊娠滋養細胞瘤組患者miR-181a表達水平線顯著低于葡糖胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組患者顯著低于對照組(P<0.05)；妊娠滋養細胞瘤組患者GATA6 mRNA表達水平線顯著高于葡糖胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組患者顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

組別miR-181aGATA6對照組(n=40) 1.02±0.261.03±0.28葡萄胎組(n=45) 0.67±0.22?1.52±0.32?妊娠滋養細胞瘤組(n=35)0.46±0.17?#1.89±0.37?#F值61.82167.163P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與葡萄胎組比較，#P<0.05

2.2 3組受試者GATA6蛋白表達水平比較 GATA6蛋白定位與細胞核，陽性呈淺黃色或棕黃色。GATA6在妊娠滋養細胞瘤患者中陽性表達率顯著高于葡萄胎組和對照組(P<0.05)；葡萄胎組顯著高于對照組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 不同妊娠滋養細胞疾病中GATA6蛋白表達 例

注：與對照組比較，*P<0.05；與葡萄胎組比較，#P<0.05

圖1GATA6在不同組織中的免疫組化表達；A、B為對照組絨毛細胞中的表達；C、D為葡萄胎組織中的表達；E、F為妊娠滋養細胞瘤組織中表達(A、C、E為蘇木精-伊紅染色法，B、D為免疫組化EnVi-son兩步法染色,×100)

2.3 葡萄胎患者組織miR-181a、GATA6表達與臨床病理特征的關系 以葡萄胎患者組織中miR-181a表達水平平均值將患者分為高表達21例和低表達24例；GATA6蛋白表達分為陽性26例和陰性19例；miR-181a、GATA6表達水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關(P<0.05)；與患者年齡無關(P>0.05)。見表4。

表4 葡萄胎患者組織miR-181a、GATA6表達與臨床病理特征的關系 例(%)

2.4 妊娠滋養細胞瘤患者組織miR-181a、GATA6表達與臨床病理特征的關系 以miR-181a表達水平平均值將患者分為高表達12例和低表達23例；GATA6蛋白表達分為陽性28例和陰性7例；miR-181a、GATA6表達水平與妊娠滋養細胞瘤遠處轉移、臨床分期、預后有關(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤直徑、轉移病灶數無關(P>0.05)。見表5。

表5 妊娠滋養細胞瘤患者組織miR-181a、GATA6表達與病理特征關系 例(%)

2.5 妊娠滋養細胞疾病組織miR-181a、GATA6 mRNA表達相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示葡萄胎患者組織中miR-181a、GATA6 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.601,P=0.000)；在妊娠滋養細胞瘤組織中miR-181a、GATA6表達水平呈負相關(r=-0.611,P=0.000)。生物信息學預測網站(http://www.targetscan.org/vert_72/)分析結果顯示GATA6是miR-181a的靶基因。見圖2。

圖2妊娠滋養細胞疾病組織miR-181a、GATA6 mRNA表達相關性分析

3 討論

GTN是與妊娠相互關聯的良性和惡性腫瘤，組織學為依據主要分為葡萄胎和妊娠滋養細胞瘤[1]。GTN具有典型早期遠處轉移和局部浸潤等特征，葡萄胎雖為良性腫瘤，若不及時發現治療，也有惡變的可能[7]?；熕幬锛盎煼绞降陌l展使妊娠滋養細胞瘤的治愈率顯著提升，但早期肺腦等器官轉移給患者手術治療和化療帶來嚴峻考驗，兩種治療方式并未顯著改善患者預后[8]。因此，更深入了解GTD的發病機制，尋找藥物作用的潛在靶點，對患者臨床治療和預后改善有重要的意義。

miRNA是一類內源性非編碼小RNA分子，通過與靶基因mRNA的5’端或3’端發生特異性結合調控靶基因的表達。miRNAs由RNA聚合酶Ⅱ經復雜的過程加工成成熟的miRNAs，成熟的miRNAs參與RNA誘導的沉默復合體中干擾靶RNA的穩定性和翻譯過程[9]。miRNA異常表達與多種良性腫瘤、惡性腫瘤、心血管疾病發生有關[10]。miR-181a表達失調與人類多種癌癥發生和預后相關[11]。Shi等[12]研究表明miR-181a通過靶向調控CDK1表達抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，提示miR-181a表達可能影響腫瘤細胞增殖。本結果顯示，miR-181a在葡萄胎和妊娠滋養細胞瘤患者組織中的表達水平顯著低于對照組，提示miR-181a低表達可能與妊娠滋養細胞疾病發生有關。臨床病例特征分析結果顯示，miR-181a表達水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關，提示miR-181a低表達可能導致滋養細胞異常增生，推測miR-181a可能參與了葡萄胎的惡性進展過程。miR-181a可通過靶向ABI1表達影響神經母細胞瘤細胞的生長、侵襲和轉移[5]，提示miR-181a與腫瘤細胞侵襲、轉移有關。本結果顯示妊娠滋養細胞瘤患者組織中miR-181a表達水平顯著低于葡萄胎組，miR- 181a表達與妊娠滋養細胞瘤遠處轉移、臨床分期、預后有關，與Feng等[11]研究miR-181a與腫瘤細胞遠處轉移、預后有關結果一致，提示miR-181a表達異常可能參與妊娠滋養細胞腫瘤的發生、侵襲、轉移過程。

GATA6是GATA家族重要成員之一，是能夠特異識別GATA序列并結合的轉錄因子，位于人類18q11.1-q11.2區段，包含7個外顯子和6個內含子[13]。GATA6在多種腫瘤組織中表達異常，參與腫瘤發生過程。在非小細胞肺癌中GATA6表達上調，是影響患者預后的危險因素[13]。本研究結果顯示，GATA6在葡萄胎和妊娠滋養細胞瘤患者組織中的表達水平顯著高于對照組，免疫組化結果與GATA6 mRNA結果有較好的一致性，提示GATA6高表達可能影響腫瘤細胞的增殖。葡萄胎患者組織中GATA6表達水平與葡萄胎患者子宮體積、β-hCG、卵巢黃素囊腫大小有關，提示GATA6高表達促進了滋養細胞腫瘤的增生，可能參與葡萄胎患者的發病。Tian等[14]研究發現MIR-124靶向GATA6抑制膽管癌細胞的侵襲和轉移，提示GATA6可能與腫瘤細胞轉移有關。臨床病理特征分析顯示GATA6表達水平與妊娠滋養細胞瘤遠處轉移、臨床分期、預后有關，提示GATA6可能通過影響腫瘤遠處轉移，間接影響患者預后。在葡萄胎、妊娠滋養細胞瘤中，miR-181a與GATA6表達水平與臨床病理特征具有較高的一致性，推測二者可能存在相關性。Pearson相關性分析結果顯示，miR-181a與GATA6 mRNA水平在葡萄胎、妊娠滋養細胞瘤患者分別呈負相關。本研究通過生物信息學預測結果顯示GATA6是miR-181a的靶基因。Zhao等[15]研究表明miR-181a靶向調控GATA6抑制人喉鱗癌的進展，提示miR-181a與GATA6在喉鱗癌中存在靶向調控關系。推測miR-181a可能靶調控GATA6表達參與妊娠滋養細胞疾病的發生和進展過程，但具體調控機制有待于進一步研究。

綜上所述，miR-181a在妊娠滋養細胞疾病中表達下調，GATA6在妊娠滋養細胞疾病中表達上調，miR-181a可能靶向調控GATA6參與妊娠滋養細胞疾病的發生過程。但miR-181a和GATA6是否存在調控關系以及具體調控機制有待進一步研究。