MMP-1、MMP-7水平與妊娠期高血壓的關(guān)系

李瑩瑩 秦福杰 翁玲君

正常妊娠與胎盤豐富和基底蛻膜螺旋動(dòng)脈的廣泛重構(gòu)有關(guān)[1]。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入蛻膜，延伸至螺旋動(dòng)脈壁，取代內(nèi)皮和肌壁，形成擴(kuò)張的低阻力血管，為發(fā)育中的胎兒維持足夠的血液和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)[2]，血壓的變化最小。這些改變涉及到顯著的胎盤和血管組織重塑，并導(dǎo)致妊娠期間子宮、胎盤和血管的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重大變化。先兆子癇是一種妊娠相關(guān)疾病，使5%～8%的妊娠復(fù)雜化，表現(xiàn)為妊娠期高血壓(HTN-Preg)，偶爾伴有蛋白尿和水腫[3]。如果治療不當(dāng)，先兆子癇會(huì)導(dǎo)致子癇，并伴有嚴(yán)重的HTN和驚厥[4]。先兆子癇也常與胎兒發(fā)育受限和宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)有關(guān)，導(dǎo)致早孕和早產(chǎn)。先兆子癇是孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病和死亡的主要原因，但其病理生理機(jī)制尚不清楚[5]。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種鋅依賴的蛋白酶，它降解細(xì)胞外基質(zhì)(Ecm)的不同成分，并在各種組織和器官的重構(gòu)中發(fā)揮作用[6]。MMPs細(xì)胞生物學(xué)的闡明遵循了它們最初的描述，即巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)物作用于膠原，但目前已知它們是由許多組織和細(xì)胞類型產(chǎn)生的，包括成骨細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞，并且具有廣泛的底物[7]。MMP家族包括膠原酶、明膠酶、基質(zhì)蛋白、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶和其他基質(zhì)金屬蛋白酶[8]。MMP-2(明膠酶a)和MMP-1和MMP-7(明膠酶b)在發(fā)情周期、月經(jīng)周期和孕期子宮內(nèi)膜組織重構(gòu)中起著重要作用[9]。雖然有研究顯示MMP-2和MMP-1和MMP-7的循環(huán)水平有所增加，但先兆子癇孕婦與正常孕婦相比，MMP-1和MMP-7水平有所下降[10]。多種生物標(biāo)志物，如MMPs和TIMPs，已經(jīng)被廣泛的研究，以進(jìn)一步了解妊娠期高血壓的疾病發(fā)病機(jī)制。我們分析MMP-1、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)和TIMP-2在妊娠期高血壓孕婦和正常妊娠中的循環(huán)水平，可使人們更好地理解與妊娠期高血壓發(fā)病機(jī)制有關(guān)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2018年8月我院收治的100例妊娠期高血壓患者為試驗(yàn)組，均為妊娠期20周后血壓≥140/90 mm Hg(2次測(cè)量間隔至少6 h)并無蛋白尿(24 h>300 mg)的孕婦。另隨機(jī)選取同期收治的100例健康孕婦為對(duì)照組。還包括試驗(yàn)組及對(duì)照組產(chǎn)婦分娩后的新生兒各100例。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)200例孕婦及其子女血清中MMP-1和MMP-7的含量。根據(jù)美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)的指導(dǎo)原則，妊娠期高血壓的定義為收縮壓≥140 mm Hg或舒張壓≥90 mm Hg，妊娠20周后無明顯蛋白尿。對(duì)照組正常妊娠，血壓正常，在整個(gè)懷孕期間沒有任何并發(fā)癥。研究前患者均獲得知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 患者在分娩前1～2 h抽取靜脈血，臍帶血在分娩后立即采集。用血清分離器收集血樣，在室溫下3 000 r/min離心分離10 min，保存在-80℃，直至實(shí)驗(yàn)室分析。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒定量測(cè)定MMP-1、MMP-7。測(cè)試方法及實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑說明書執(zhí)行。由于子癇前期的所有女性是通過剖腹產(chǎn)分娩，因此，由于臨床指標(biāo)，對(duì)照組也從剖腹產(chǎn)分娩的女性中采集對(duì)照樣本。對(duì)照組剖宮產(chǎn)指征：胎兒橫位或臀位，眼科指征，骨科指征或因剖宮產(chǎn)增加子宮破裂風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 基因分型法 用試劑盒從母血和胎兒血中分離出DNA。PCR反應(yīng)的引物如下：MMP-1_F_5’-GAG TAT ATC TGC CAC TCC TTG AC-3’；MMP-1_R_5’-CTT GGA TTG ATT TGA GAT AAG TCA TAG C-3’；MMP-2_-735C/T_F_5’-GGT GGG TGC TTC CTT TAA CAT G-3’；MMP-2_-735C/T_R_5’-GTA AAA TGA GGC TGA GAC CTG C-3’；MMP-2_-1306C/T_F_5’-CTT CCT AGG CTG GTC CTT ACT G-3’；MMP-2_-1306C/T_R_5’-GCT GAG ACC TGA AGA GCC A-3’；MMP-3_F_5’-CAT TCC TTT GAT GGG GGG AAA gA-3’；MMP-3_R_5’-GAA GGA ATT AGA GCT GCC ACA GC-3’；MMP-9_F_5’-GCA GAT CAC TTG AGT CAG AAG TTC-3’；MMP-9_R_5’-GGG AAA AAC CTG CTA ACA ACT C-3’。采用以下限制性內(nèi)切酶：AluI、HinfI、BstXI、Tth111I和SphI。用6%聚丙烯酰胺凝膠分析產(chǎn)物，用溴化乙錠染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Statistica v12 (StatSoft，Tulsa，OK)軟件。臨床資料和個(gè)人特征資料均呈正態(tài)分布，用t檢驗(yàn)法比較各組間的差異。母親和胎兒對(duì)照組檢測(cè)HardyWeinberg平衡。使用chi2或Yates’校正的chi2檢驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)稱變量比較。對(duì)單因素分析中有顯著性差異的變量進(jìn)行多元逐步Logistic回歸分析(P<0.05)。以95%置信區(qū)間(95%CI)計(jì)算多變量和單因素分析得到的重要參數(shù)的優(yōu)勢(shì)比(OR)。單倍型分析(單倍型頻率估計(jì)和連鎖不平衡)在母體研究組和對(duì)照組以及先兆子癇和非復(fù)雜妊娠胎兒組之間進(jìn)行；為此目的使用了在線snpstat軟件。對(duì)每個(gè)單倍型的發(fā)病，計(jì)算累積頻率，并利用snpstat軟件進(jìn)行Logistic回歸分析，計(jì)算最常見的單倍型集(作為單倍型起效分?jǐn)?shù)<0.9的累積頻率)與先兆子癇的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本試驗(yàn)共選取對(duì)象400例，2組均為單胎妊娠、妊娠前無高血壓或糖尿病、無妊娠期糖尿病、胎兒無染色體畸變、孕婦孕前體重指數(shù)≤30 kg/m2、無其他慢性母體疾病。試驗(yàn)組產(chǎn)婦年齡明顯高于對(duì)照組，試驗(yàn)組收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.05)。試驗(yàn)組分娩時(shí)胎齡和平均出生體重低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1、2。

項(xiàng)目試驗(yàn)組對(duì)照組P值年齡中位數(shù);IQR(歲)31;27～3628;26～320.009BMI(kg/m2)26.0±3.125.0±4.30.015WBC(103/μl)10.6±2.310.7±2.30.712RBC(103/μl)4.1±0.54.1±0.40.648HB(g/dl)12.2±1.412.4±1.10.474HCT(%)35.7±3.436.2±2.50.313MCV(fl)85.4±6.587.1±5.20.071MCHC(g/dl)34.3±2.633.8±1.70.126PLT(103/μl)203.4±60.5220.4±54.20.057有流產(chǎn)史[例(%)]19(19.0)15(15.0)0.564收縮壓(mm Hg)141±7112±110.001舒張壓(mm Hg)91±766±70.001

注：BMI：體重指數(shù)；WBC：白細(xì)胞；RBC：紅細(xì)胞；HB：血紅蛋白濃度；HCT：紅細(xì)胞壓積；MCV：平均微粒體積；MCHC：平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度；PLT：血小板

2.2 2組孕婦血清情況 試驗(yàn)組循環(huán)系統(tǒng)MMP-9水平高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TIMP-1和TIMP-2在試驗(yàn)組僅表現(xiàn)為低表達(dá)。對(duì)試驗(yàn)

項(xiàng)目試驗(yàn)組對(duì)照組P值體重(g,x±s)2 469.3±923.13 407.4±448.0<0.001身高(cm,x±s)49.0±6.454.1±2.8<0.0011 mim Apgar評(píng)分(分,x±s)8.6±1.49.4±0.8<0.001男嬰[例(%)]60(60.0)45(45.0)<0.05分娩時(shí)胎齡(周,x±s)37.6±1.138.3±1.1<0.001

組進(jìn)行多因素分析，發(fā)現(xiàn)TIMP-1與母親年齡呈弱正相關(guān)(r=0.278，P=0.047)，與母親年齡呈弱負(fù)相關(guān)(r=0.293，P=0.036)。對(duì)照組TIMP-2與胎齡呈弱正相關(guān)(r=0.318，P=0.010)。生物標(biāo)志物與血壓無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

項(xiàng)目試驗(yàn)組對(duì)照組P值MMP-1(ng/ml)2 244.30±1 176.641 875.97±1 121.530.085TIMP-1(ng/ml)813.70±217.66766.08±134.360.165TIMP-2(ng/ml)133.96±46.38130.93±40.400.706MMP-1/TIMP-1(中位數(shù);IQR)2.74;1.53～3.992.37;1.27～3.360.204MMP-1/TIMP-2(中位數(shù);IQR)17.26;10.17～23.9311.99;7.14～22.210.139

2.3 母胎MMP基因多態(tài)性對(duì)妊娠期高血壓發(fā)病的影響 單因素分析表明，孕婦MMP1 1G/1G純合性和MMP3 5A/5A純合性在妊娠期高血壓女性中較為常見。妊娠期高血壓的發(fā)生與所研究的母體MMP-1和MMP-7基因多態(tài)性的基因型或等位基因分布無關(guān)。見表4。

表4 妊娠期高血壓與試驗(yàn)組母體基因型比較 n=100,例

注：HWE：HardyWeinberg平衡

2.4 試驗(yàn)組和對(duì)照組胎兒基因型和等位基因的分布情況 -1607 1G/2G MMP-1(rs1799750)、-735 C/T MMP-2(rs2285053)、-1306 C/T MMP-2(rs243865)、-1171 5A/6A MMP-3(rs35068180)基因型和等位基因的單因素分析顯示，在子癇前期兒童中，胎兒5A/6A MMP-3雜合率明顯增高。妊娠期高血壓的發(fā)生與所研究的胎兒MMP-2和MMP-9基因多態(tài)性的基因型或等位基因分布無關(guān)。見表5。

3 討論

研究表明MMP-1和MMP-7參與心血管疾病，包括對(duì)照組和妊娠期高血壓[11]。我們?cè)谠囼?yàn)組患者中發(fā)現(xiàn)MMP-1和MMP-7水平相對(duì)升高，與其他的研究結(jié)果[12]一致。然而，一些其他的研究發(fā)現(xiàn)在循環(huán)MMP-1和MMP-7水平上沒有明顯的變化，這可能是由于正常的胎盤在孕婦中的對(duì)照組[13]。一項(xiàng)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，與正常胎盤相比，胎盤組織中MMP-1和MMP-7的表達(dá)降低[14]。在妊娠期高血壓中，滋養(yǎng)層浸潤(rùn)不良和植入受損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放和炎性反應(yīng)。另一項(xiàng)體外研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等細(xì)胞因子通過刺激細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞而增加MMP-1和MMP-7的生成[15]。在妊娠期高血壓中，血清MMP-1和MMP-7被認(rèn)為與炎癥過程有關(guān)，因?yàn)檠錞NF受體1型水平升高[16]。這些事件可能改變正常的MMP/TIMP比值。然而，本研究結(jié)果表明，對(duì)照組孕婦的MMP-1和MMP-7水平僅略有上升，這可能是因?yàn)樽甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲在對(duì)照組中的情況可能要好于妊娠期高血壓。與年齡較小的個(gè)體相比，老年人MMP的凈活性較低，表明細(xì)胞外基質(zhì)降解能力下降。這與我們的研究是一致的，因?yàn)樵谠囼?yàn)組，TIMP-1與年齡的增加呈正相關(guān)。本結(jié)果顯示TIMP-2與胎齡呈正相關(guān)，這也與以前的研究[2]一致。這些研究報(bào)告說，TIMP-1和TIMP-2在妊娠晚期增加，反映了它們?cè)谡麄€(gè)妊娠期間血管重構(gòu)中的作用。雖然發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)MMPs和TIMPs與高血壓呈正相關(guān)，但本結(jié)果并非如此，提示可能有不同的病理生理機(jī)制參與了對(duì)照組。

表5 妊娠期高血壓和非復(fù)雜妊娠患兒基因型比較 n=100,例

本研究中，妊娠期高血壓患者的血清MMP-1和MMP-7水平高于血壓正常的孕婦。然而，這項(xiàng)研究并非沒有限制。2組間缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，可能是由于我們的樣本相對(duì)較小。也有可能由于多種族研究樣本的影響，結(jié)果可能是不正確的，因?yàn)楦蟮难芯堪l(fā)現(xiàn)不同種族群體之間的MMP-1和MMP-7水平發(fā)生了變化。另一個(gè)可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素是樣本的類型，在一些研究中已發(fā)現(xiàn)血清MMP-1和MMP-7水平的人為改變。盡管如此，這項(xiàng)研究提供了有用的基線信息，具有未來的意義。