miR-205靶向調控PLCε抑制膀胱癌T24細胞EMT和遷移的作用機制研究

孫賓 劉多鳳 陳建華

EMT; invasion; metastasis

膀胱癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，發病隱匿，轉移率高。早期膀胱癌患者中，肌層浸潤性膀胱癌約占30%左右，其中1/2的患者發現時已出現遠處轉移。發生轉移后患者的生存率明顯下降，即使采用手術切除與聯合化療方法治療，5年的生存率不足30%[1]，因此預防和控制膀胱癌向深處浸潤和遠端轉移是目前醫學工作者不斷探索的難題。有研究報道上皮間質轉化(EMT)是癌細胞出現轉移的驅動力，因此研究EMT發生分子機制，是提高腫瘤診治的關鍵[2]。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶Cepsilon(PLCε)作為癌基因Ras的效應分子，近年來發現其在惡性腫瘤的發生發展過程中起著關鍵作用[3,4]，有文獻報道PLCε在膀胱癌組織中呈現高表達狀態，且能夠促進癌細胞發生EMT和轉移[5]。miRNA作為全長含有20～25個核苷酸的小分子RNA，能夠通過與靶基因mRNA的 3’端結合，從而抑制靶基因翻譯。有文獻表明miRNA在腫瘤的增殖、轉移和侵襲過程中起著至關重要的作用[6,7]。有研究發現miR-205在乳腺癌[8]、卵巢癌[9]中起到促癌基因作用，在胃癌[10]中起到抑癌基因的作用，但其在膀胱癌中的研究筆者尚未見報道。本研究采用生物信息學工具預測靶向調控PLCε的miRNA，同時上調/沉默miR-205表達，觀察對膀胱癌T24細胞EMT和遷移的影響，為治療膀胱癌提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2018年12月于我院就診且經病理學確診的膀胱癌患者癌組織及癌旁組織80例，其中男40例，女40例；年齡35～60歲，平均年齡(40.45±7.54)歲；術前患者均未進行放化療?；颊呒凹覍俸炇鹬橥鈺?。膀胱癌T24細胞采購自ATCC細胞庫。

1.2 試劑與儀器 胰蛋白酶、qRT-PCR檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；RPIM1640細胞培養基購自購自美國Gibco公司；Trizol總RNA 提取試劑盒購自廣東銳博生物科技技術股份有限公司；miR-205 inhibitors、miR-205mimics和陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司代為合成；Lipofectamine 2000購自美國 Invitrogen 公司；青、鏈霉素購自華北制藥有限公司、SYBR Premix Extaq system 日本 Takara 公司、Transwell小室及相應產品購自美國Corning公司；細胞培養箱采購自上海三騰儀器有限公司。PTEN 兔抗 (WB)、PTEN 兔抗 (IHC)、Occludin 兔抗購自美國abcam公司、二抗(IHC)、Actin 鼠抗購自Fermentas 公司。實時熒光定量PCR儀購美國Thermo 公司、恒溫培養箱購自一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養：從液氮中取出人膀胱癌細胞系T24，置于37℃水浴溶解，加入含有10%FBS的RPIM1640培養基中，離心去上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種于培養瓶中，37℃，5%CO2培養，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡觀察，加入10%胎牛血清 1640 培養基終止消化，加入到10%FBS的RPIM1640種，37℃，5%CO2培養傳代。傳代次數一致且細胞處于對數期且用于后續研究。

1.3.2 實時定量PCR檢測miR-205的表達:取膀胱癌及癌旁組織研磨加入裂解液，混合作用10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，離心取上清，加入Trizol與氯仿震蕩混合均勻，12 000 r/min 離心20 min，加入異丙醇，12 000 r/min離心后，棄上層清液，取管底絮狀沉淀，加入Trizol與乙醇混合液，離心棄上清，沉淀則為細胞RNA。將RNA用DEPC水溶解，反轉錄試劑盒轉錄cDNA。按照SYBR方法進行實時定量PCR，并以Actin為內參。反應條件為94℃，30 s，1 cycle；95℃，5 s，60℃，30 s，40 cycles；95℃，5 s，60℃，1 min，95℃，1 cycle。結果用2-ΔΔCT表示。檢測各組基因的表達量。引物miR-205 上游5’-ACTCAGTAACCCACACA-3’下游5’-GGGTCCACACTGTGGT-3’。

1.3.3 細胞轉染：調整膀胱癌細胞T24細胞濃度為1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養過夜，采用Lipofectamine2000將濃度均為100 nM的miR-205 inhibitor、miR-205 mimics和陰性對照轉染至細胞，以空脂質體作為對照。qRT-PCR檢測miR-205的表達量。

1.3.4 蛋白免疫印跡檢測E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的表達:取轉染48h細胞，RIPA裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。BCA定量法檢測蛋白濃度，待測樣品和Loading buffer混合，100℃水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.3.5 細胞侵襲實驗:稀釋液與基底膠質按7∶1體積混合，吸取8 μl的Matrigel覆蓋于transwell小室微孔膜底部，37℃放置30 min，10%FBS的RPIM1640調整 T24 細胞的濃度為1×105， 含5%胎牛血清的培養基加入到下室中，上室加入培養的細胞， 37℃ 5%CO2培養，擦去癌細胞和基質膠，95%乙醇固定15 min；用1%的結晶紫染色30 min，PBS沖洗多余染料，放于高倍鏡視野計數穿透細胞數。

1.3.6 細胞遷移實驗:取轉染48 h 的細胞，0.25%胰酶消化，RPIM1640培養基調整細胞濃度1×105，接種于6孔板中，37℃，5%CO2培養過夜。待細胞均勻融合于培養板底部，用一次性接種環畫出無細胞區后劃橫線，采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細胞并進行拍照，實驗分為3組：對照組、miR-205 inhibitors組、miR-205 mimics組。培養24 h后進行拍照，觀察細胞遷移能力。

1.4 雙熒光素酶報告基因測定 使用生物信息學網站Target Scan數據庫預測PLCε可互補結合的微小RNA(microRNA，miRNA)，以正常人基因組DNA為模板，采用PCR擴增含有miR-205、PLCε互補位點，構建至熒光素酶報告基因載體psi-CHECK中，記為野生型，同時構建突變型重組質粒mutant。將HEK293T 細胞按30%左右密度鋪24孔板，分別將海腎熒光素酶質粒、miR-205及其陰性對照分別與野生型及突變型mutant共轉染至HEK293T細胞。轉染后24 h，根據雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報告基因活性。

2 結果

2.1 miR-205在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達 qRT-PCR結果顯示細胞癌組織中miR-205的表達量顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

類別miR-205相對表達量膀胱癌組織0.32±0.13癌旁組織 0.97±0.07t值39.376P值<0.001

2.2 miR-205 在轉染后膀胱癌細胞系T24的表達 miR-205 inhibitors、miR-205mimics和空脂質體轉染膀胱癌細胞系T24 后，RT-PCR檢測結果顯示miR-205 inhibitors組中miR-205的表達明顯低于對照組(P<0.05)，miR-205mimics組中miR-205的表達明顯高于對照組(P<0.05)。提示成功構建miR-205沉默細胞株/過表達細胞株。見表2，圖2。

圖1 miR-205在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達

表2 3組細胞中miR-205相對表達量

組別miR-205相對表達量對照組 1.04±0.05miR-205mimics組 2.87±0.11?miR-205 inhibitors組0.15±0.02?F值8.279P值<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2 RT-PCR檢測miR-205在膀胱癌細胞T24中的表達

2.3 miR-205-對T24細胞侵襲能力的影響 miR-205 inhibitors組中穿透細胞數明顯高于對照組(P<0.05)，miR-205 mimics組中穿透細胞數低于對照組(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24癌細胞侵襲能力。見表3，圖3。

組別穿透細胞數/視野對照組 94±9miR-205mimics組 55±8?miR-205 inhibitors組364±18?F值65.298P值<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

2.4 miR-205對T24膀胱癌遷移能力的影響 miR-205 inhibitors組T24遷移率高于對照組(P<0.05)，miR-205 mimics組T24遷移率明顯低于對照組(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24細胞的遷移能力。見表4，圖4。

組別細胞遷移率(%)對照組 79.31±4.56miR-205mimics組 50.19±4.32?miR-205 inhibitors組96.27±4.34?F值83.212P值<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

2.5 miR-205對E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的影響 Western blot檢測結果顯示miR-205 inhibitors組中上皮標志物E-Cadhein的表達明顯低于對照組(P<0.05)，間質標志物Vimentin、Slug的表達明顯高于對照組(P<0.05)，miR-205 mimics組上皮標志物E-Cadhein的表達明顯高于對照組(P<0.05)，間質標志物Vimentin、Slug的表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，圖5。

miR-205 mimics組對照組miR-205 inhibitors組

圖3miR-205對膀胱癌細胞T24侵襲能力的影響(結晶紫染色×200)

圖4 miR-205對T24遷移能力的影響(×100)

組別E-Cadhein相對表達量Vimentin相對表達量Slug相對表達量對照組 1.12±0.151.17±0.111.16±0.09miR-205mimics組 2.87±0.24?0.23±0.07?0.27±0.08?miR-205 inhibitors組0.24±0.06?3.98±0.21?4.17±0.22?F值13.26519.28724.314P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05

圖5 miR-205對E-Cadhein、Vimentin、Slug蛋白的影響

2.6 熒光素酶實驗結果 經Target Scan數據庫分析發現PLCε和miR-205之間有互補結合序列，推測兩者可能具有靶向調控關系。雙熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miR-205后，野生型PLCε的熒光素酶活性被抑制(P<0.05)，突變型PLCε的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，證實PLCε和miR-205具有靶向調控關系。Western blot檢測上調miR-205細胞系和空白細胞對照中PLCε結果表明，上調miR-205后，PLCε表達水平顯著下降(P<0.05)，證實miR-205可以特異性結合PLCε并發揮負向調控作用。見表6、7，圖6、7。

組別熒光素酶活性相對表大量野生型突變型miR-205組0.56±0.091.54±0.17對照組 1.45±0.121.48±0.12t值13.2670.645P值<0.0010.535

圖6熒光素酶時間檢測miR-205與PLCε相互作用關系

組別PLCε相對表達量對照組 0.95±0.06miR-205mimics組0.29±0.08t值14.758P值<0.001

圖7miR-205對PLCε表達的影響

3 討論

膀胱癌為危害人類健康的的重要疾病之一，在我國的檢出率和發病率呈遞增趨勢，研究顯示，男性膀胱癌在所有惡性腫瘤中排第七位，其生物學行為復雜，易出現轉移和復發，文獻報道初發的膀胱癌約有1/3的患者出現局部進展和遠處轉移，其5年生存率較低，如何控制膀胱癌細胞組織浸潤和轉移是成為醫學科研工作者不斷探尋的課題[11-13]。

miRNA是一類廣泛分布于哺乳動物細胞中的小分子RNA，通過堿基不完全互補的方式結合于靶基因上導致基因降解，從而抑制蛋白合成[14]。miR-205是由一段UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG編碼的miRNA，文獻報道稱其在多種系中高度保守，且其在多種腫瘤細胞中發揮著抑癌或促癌的作用，但其在膀胱癌中的作用筆者尚未見有報道，本研究采用RT-PCR檢測其在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達，結果顯示膀胱癌組織中miR-205表達水平明顯低于癌旁組織，提示miR-205在膀胱癌可能起到抑癌的作用。

為進一步研究miR-205在膀胱癌侵襲與轉移中的作用，本研究通過上調/下調miR-205觀察T24細胞系侵襲遷移能力變化，Transwell結果顯示miR-205 inhibitors組中穿透細胞數明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-205 mimics組中穿透細胞數明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24癌細胞侵襲能力。劃線法結果顯示miR-205 inhibitors組T24遷移率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-205 mimics組T24遷移率明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-205能夠抑制T24細胞的遷移能力。

EMT是上皮細胞受到癌細胞浸潤轉變為具有轉移能力的間質細胞的過程，惡性腫瘤通過上皮間質化實現浸潤、擴散、轉移，因此EMT在癌癥轉移中具有重要的意義[15,16]。本研究采用Western blot檢測上調/下調miR-205后上皮標志物E-Cadhein，間質標志物Vimentin、Slug的表達量，提示miR-205能夠抑制T24癌細胞EMT進程，綜合Transwell和劃線法結果提示miR-205抑制膀胱細胞侵襲和轉移可能是通過抑制EMT實現的。

PLCε位于人類染色體10q23，作為新發現的和腫瘤發生相關的基因，有報道其在膀胱癌中起到促癌的作用[17]，且其表達水平與膀胱癌患者臨床分期有關，有學者采用慢病毒干擾技術沉默其表達，發現膀胱癌細胞的增殖遷移能力檢索，且EMT標志物也顯著下調[18]，本研究采用生物信息學預測顯示miR-205和PLCε存在靶向結合區域，進一步的采用熒光素酶實驗，驗證了二者存在靶向調控關系，且miR-205能夠負相調控PLCε。

綜上所述，miR-205在膀胱癌中作為抑癌基因，能夠靶向調控PLCε 抑制膀胱癌T24細胞EMT和遷移的作用。