洋蔥外植體的組織培養(yǎng)方法與對策

何林玉，惠林沖，陳微，楊海峰，李威亞，繆美華，陳振泰，潘美紅

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究室，江蘇 連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)是百合科蔥屬2年生植物，是重要的園藝蔬菜之一，已有4 000多年的栽培歷史，在中國廣泛栽培。洋蔥選育周期長，遺傳背景復(fù)雜，雜種優(yōu)勢明顯。在洋蔥雜交育種中，對優(yōu)良的不育系親本材料進行擴繁，需要利用組織培養(yǎng)的方法。本實驗室目前只掌握了利用洋蔥外植體進行愈傷誘導(dǎo)的方法，再生體系還未建立。在洋蔥組織培養(yǎng)中，經(jīng)常會出現(xiàn)污染現(xiàn)象，浪費了大量的耗材和人力。所以本研究對洋蔥外植體的組織培養(yǎng)方法進行研究，以減低污染率，為洋蔥現(xiàn)代化分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 器材消毒與滅菌

鑷子、超純水、培養(yǎng)皿、1 mL槍頭(放入組培瓶中)、手術(shù)刀、配套的濾紙(放入相對應(yīng)的培養(yǎng)皿內(nèi))均用報紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)121 ℃高壓滅菌20 min[1]。組培室開紫外燈30 min后關(guān)閉，約20 min后進入組培室關(guān)閉超凈工作臺和室內(nèi)的紫外燈。

1.2 培養(yǎng)基的制備

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入1.8 mg·L-12,4-D、30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH為6.0～6.2，編號為①。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入8 g·L-1瓊脂、30 g·L-1蔗糖，調(diào)節(jié)pH為6.0～6.2，編號為②。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入1.0 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-16-BA、30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH為6.0～6.2，編號為③。90 mm培養(yǎng)皿用報紙包好，與培養(yǎng)基一同放入滅菌鍋內(nèi)121 ℃高壓滅菌20 min。將2 mg·L-1甘氨酸、1 g·L-1酪蛋白水解物、690 mg·L-1脯氨酸溶于無菌水中[2]，在超凈工作臺內(nèi)用0.22 μm一次性過濾器過濾除菌后加入滅完菌的培養(yǎng)基①、③內(nèi)，充分搖勻后用90 mm培養(yǎng)皿進行分裝，每個培養(yǎng)皿約30 mL培養(yǎng)基。

1.3 洋蔥外植體消毒

鱗莖盤消毒：選取無病蟲害、球形較好的洋蔥蔥球，剝?nèi)ネ獗砥ず腿赓|(zhì)鱗片約2/3，去掉底部須根，注意勿傷及鱗莖盤及其生長點。自來水下沖洗約20 min，放入工作臺中消毒備用。在工作臺內(nèi)用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗1次，有效氯為14%的次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干表面水分[2]。

種子消毒：選取顆粒飽滿的洋蔥種子，自來水下沖洗10 min，超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗1次，有效氯為2%的次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干表面水分。因洋蔥種子質(zhì)量小，易漂浮，消毒過程中可來回輕微晃動，使其充分與消毒液接觸，也可用無菌紗布套住消毒瓶口，倒掉廢液時防止種子隨廢液一起流出。

花苞消毒：選取無病蟲害且未開的花苞，留花梗約5 cm，置于自來水下沖洗10 min，在超凈工作臺內(nèi)用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗1次，有效氯為10%的次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干表面水分。

花朵消毒：選取無病蟲害且未開放的2.5～3.5 mm的花蕾[3]，留花柄約1.0 cm，剪去其他部分，自來水下沖洗20 min，超凈工作臺內(nèi)用70%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗1次，有效氯為2%的次氯酸鈉浸泡消毒15 min，無菌水沖洗3～4次，在無菌濾紙上晾干表面水分。

1.4 外植體接種培養(yǎng)基

晾干水分的鱗莖盤，用無菌刀片切去與消毒液接觸的表面，取中間部分約5.0 mm×5.0 mm×2.5 mm的小塊，按照洋蔥自然生長方向放置于培養(yǎng)基①內(nèi)，每皿約15個。放于(25±2)℃黑暗條件下培養(yǎng)。約7 d后，鱗莖盤開始長出愈傷，約2周后愈傷長成；在超凈工作臺內(nèi)用無菌刀片切去老的鱗莖盤部分，留新鮮愈傷，放于新的培養(yǎng)基①內(nèi)，于(25±2)℃黑暗培養(yǎng)[4]。

晾干水分的洋蔥種子，用無菌鑷子正放于培養(yǎng)基②內(nèi)，每皿約25粒。放于(25±2)℃的黑暗條件下培養(yǎng)，約7 d后，種子長出嫩芽，超凈工作臺內(nèi)用無菌刀片切去嫩芽，將嫩芽、胚根整齊放于培養(yǎng)基①內(nèi)，于(25±2)℃黑暗培養(yǎng)。

晾干水分的花苞，用無菌刀片切去花蕾與花柄部分，留花薹，將花薹切成5 mm×5 mm×5 mm的正方體，按照洋蔥花薹自然生長方向正放于培養(yǎng)基①內(nèi)，約7 d后，愈傷開始長出，約2周后愈傷長成；在超凈工作臺內(nèi)用無菌刀片切去老的花薹，留新鮮愈傷，放置于新的培養(yǎng)基①內(nèi)，(25±2)℃黑暗培養(yǎng)。

晾干水分的花蕾，用無菌刀片切去花柄與消毒液接觸的表面部分，留花柄約1 cm。將花柄輕插培養(yǎng)基③表面，每皿約20個。放于光照下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥外植體接種培養(yǎng)基的污染率

洋蔥外植體接種培養(yǎng)基2～3 d開始出現(xiàn)污染，有真菌或細菌污染，以真菌污染為主，其中灰霉菌最多，其次是綠霉菌。種子和花薹的污染主要為真菌污染(表1)，花薹污染率最低(30%)，種子污染率最高(達75%)。花蕾污染主要是細菌性污染，尤其是培養(yǎng)后期細菌污染率更高。

表1 不同洋蔥外植體愈傷誘導(dǎo)的污染率

2.2 洋蔥外植體繼代培養(yǎng)污染

在洋蔥外植體繼代培養(yǎng)中，鱗莖盤、花薹在培養(yǎng)基上形成愈傷后，繼代培養(yǎng)的污染率在20%；種子未形成愈傷，未進行繼代培養(yǎng)。花蕾在培養(yǎng)基中花苞開放，雌蕊膨大，由于花蕾單倍體培養(yǎng)周期長達3月，后期轉(zhuǎn)接污染率在70%。

2.3 洋蔥愈傷組織中后期培養(yǎng)污染源位置

繼代培養(yǎng)后，由于操作過程中鑷子、超凈工作臺滅菌不徹底，操作者的手帶菌等造成的污染，培養(yǎng)基在3～5 d便會有真菌或細菌污染。洋蔥組織培養(yǎng)中接種15 d以后開始有污染，90%的污染源位置集中在培養(yǎng)皿的四周，很少有污染源位置在培養(yǎng)皿中間(表2)。細菌性污染非常少，主要為真菌污染，且污染位置集中在外植體放置培養(yǎng)基位點周邊空白處，緊貼培養(yǎng)皿邊，多為繼代培養(yǎng)15 d后出現(xiàn)污染，說明污染源是外部傳入，培養(yǎng)基和愈傷組織均未帶污染源。推測封口膜(parifilm)在培養(yǎng)過程中開口是導(dǎo)致污染的主要原因，封口膜未進行消毒和滅菌(圖1)。

表2 洋蔥繼代培養(yǎng)15 d后的污染源情況

圖1 洋蔥愈傷組織污染源位置

3 小結(jié)

本實驗選擇的4種洋蔥外植體，以鱗莖盤和花薹愈傷組織誘導(dǎo)率最好，高達100%，而且鱗莖盤和花薹的污染率也較低。本研究發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)后期由于封口膜漏氣或破裂導(dǎo)致污染率較高，由于封口膜無法高壓滅菌，故建議采用能夠高壓滅菌的塑料封口膜，降低污染。在洋蔥愈傷組織分化、生根誘導(dǎo)過程中，我們進行了大量配方研究，在分化培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出大量的根，在光照下根部有葉綠體出現(xiàn)，但均未誘導(dǎo)發(fā)芽。后續(xù)還需對外植體基因型和誘導(dǎo)激素組合進行大量篩選，以期誘導(dǎo)出洋蔥苗，建立穩(wěn)定的再生體系。