白芷HPLC指紋圖譜的研究

張 燁，孫艷雪，馬宇衡, 屠鵬飛，薛培鳳*

（1.內蒙古醫科大學 藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.北京中醫藥大學中藥學院 中藥現代研究中心，北京 100029）

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，為《中國藥典》（2015年版一部）收載的中藥材之一。白芷為傳統中醫臨床常用藥物，其藥用價值較為廣泛，其銷量也在逐年增加，在中藥材的對外交易中占重要地位，遠銷日本、東南亞等地。由于野生資源日益匱乏，現在的白芷主要為栽培品[1]。

白芷藥用歷史悠久，具有鎮痛[2]、抗炎[3]、美白[4]、抗腫瘤[5]等功效。白芷化學成分較為復雜，主要為香豆素類[6]和揮發油類[7]。白芷一般按其產地分為杭白芷、川白芷、禹白芷和祁白芷。受藥材植物來源、生長環境、加工方式等因素的影響，不同產地的白芷質量也會存在一定差異[8]。加之與日俱增的白芷代用品、相似品和地方白芷品種在市場上交易，因此需創建一個全面的、系統的白芷質量控制分析方法。中藥指紋圖譜具有全息性、客觀性、準確性、整體性及模糊性的特征，能較好地表征中藥化學物質組成的整體性及復雜性，全面地反映中藥中的化學成分信息，被廣泛運用到中藥質量評價中[9]。

本文采用二元梯度洗脫模式，建立了不同產地的21批白芷藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。共確定了20個共有色譜峰，并將其色譜峰導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A版）軟件，對其質量進行評價, 取得了較為滿意的結果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C高效液相色譜儀（包括四元泵，在線脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，日本島津）； BSA124S型電子分析天平（Sartorius）；KH-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

本研究所用的21批白芷藥材采集于各地藥店。樣品經內蒙古醫科大學藥學院王素巍老師鑒定，見表1。樣品預處理：粉碎機粉碎，過4號篩（65目），置密封袋中，干燥、避光條件下密封保存并編號。歐前胡素對照品（批號：110826-201916），異歐前胡素對照品（批號：110827-201911），水合氧化前胡素對照品（批號：Y07M9H55367），比克白芷素對照品（批號：110826-201916），cnidilin對照品（批號：Y07M9Q45983）均購于上海源葉生物科技有限公司，質量分數均達98 %以上。甲醇（色譜純，美國J T Baker公司）；其他試劑均為分析純；雙蒸水（自制）。

1.3 數據處理軟件

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件（2012A版）對數據進行處理。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.01 %三氟乙酸水溶液；B為甲醇。實驗采用二元梯度洗脫（見表2）。流速為1 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為300 nm，進樣量10 μl。

表1 21批白芷樣品的來源

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

精密稱取歐前胡素對照品、異歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每毫升含歐前胡素、異歐前胡素分別為20，10 μg的對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備

取白芷樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置50 ml具塞三角瓶中。加入甲醇25 ml，搖勻，稱定，密塞，編號并記錄。超聲提取1 h，共提取1次。提取結束后冷卻至室溫。用100 %甲醇補足重量，搖勻，轉移至離心管中，離心，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術指南》[10]，將所得的色譜圖轉換成AIA格式后輸入相似度評價軟件，通過比較圖譜的相似度進行方法學考察。

2.4.1 精密度考察 按2.3項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣分析，連續進樣6次。將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進行比較。結果發現其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 重現性考察 平行制備6份供試品溶液，分別進樣分析，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進行比較。結果發現其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，說明該方法的重現性較好。

2.4.3 穩定性考察 取同一份供試品溶液，按2.1項色譜條件分別在0，2，4，8，16，24 h進樣分析，將色譜圖輸入相似度評價軟件進行比較。結果表明，其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 白芷HPLC標準指紋圖譜的建立及分析

取采集的21批白芷藥材樣品，分別按2.1項色譜條件進樣分析，得到各批藥材的HPLC指紋圖譜。建立對照指紋圖譜（見圖1），并將所得色譜圖輸入相似度評價軟件進行分析，結果見表3。

表3 21批白芷樣品的相似度評價結果

圖1 21批白芷樣品色譜重疊峰

標準指紋圖譜反映了藥材化學成分的基本特征，為不同批次的藥材比對提供了參考。本通過對21批次白芷樣品的相似度進行比較可見，17號樣品藥材的指紋圖譜相似度較大，表明其質量較好，較為完整地反映了白芷藥材的基本特征。因此可將此樣品的指紋圖譜作為白芷藥材的標準指紋圖譜（見圖2）。

圖2 17號樣品圖譜與標準指紋圖譜的比較

如圖2所示，標定出20個共有峰。其中16號色譜峰滿足內參照峰的2個條件：與相鄰的色譜峰分離良好；為各待測樣品共有色譜峰。

按2.1項色譜條件，將配制好的對照品溶液逐一進行HPLC-DAD分析，經與對照品的保留時間、紫外吸收等信息進行比較，鑒別了標準指紋圖譜中的5個峰，結果見圖3。

圖3 白芷HPLC標準指紋圖譜色譜峰的鑒別

3 討論

3.1 供試品的制備方法考察

3.1.1 提取方法的考察 較常用的中藥化學成分的提取方法有超聲法、冷浸法及回流法。分別取以上3種提取方法所得的供試品溶液10 μl，進行HPLC分析。結果發現，超聲提取法峰面積相對較大。超聲波獨特的物理特性，使中藥有效成分提取更充分，提取效率更高，因此選用超聲提取法。

3.1.2 提取溶劑的考察 文獻多以乙醇及甲醇為提取溶劑。以乙醇及甲醇為溶劑，采用超聲法提取，而后進樣分析。通過HPLC計算兩圖譜中色譜峰的數目、峰高及峰面積得出結論，甲醇提取效率明顯優于乙醇，最終選擇甲醇作為提取溶劑。

3.1.3 提取條件的優化 考察甲醇濃度，溶劑體積、提取時間、提取次數對白芷提取效果的影響。結果發現，取白芷樣品約1.0 g，加25 ml甲醇提取1 h，共提取1次，提取效果最佳。

3.2 色譜條件的選擇與優化

3.2.1 檢測波長的選擇 本研究采用二極管陣列檢測器（DAD）在210～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，綜合比對不同波長下色譜圖中色譜峰的數目、峰高及峰面積，最終確定了300 nm為最佳檢測波長。

3.2.2 流動相的選擇 本實驗考察了甲醇-水、甲醇-水-三氟乙酸、乙腈-水、乙腈-水-三氟乙酸4種流動相系統，其中用甲醇-水-三氟乙酸系統即能使其成分得到很好的分離。所以最終選定甲醇-三氟乙酸水作為流動相。

3.2.3 柱溫的選擇 本實驗分別考察了25，30，35℃ 3個不同柱溫對的色譜峰的影響，通過比較，最終確定了柱溫為30 ℃時，各色譜峰的分離效果較好。

4 結論

本文選取了21批白芷樣品創建共有模式，較好地保證了共用模式創建的全面性、代表性和科學性。全國各地收集的21批白芷藥材相似度介于0.732～0.968之間，說明所收集樣品具有一定的代表性，與此同時反應了市場上流通的白芷質量良莠不齊，須加以區分。相似度在0.9以上的有19批，另外兩批相似度分別為0.732，0.783。由指紋圖譜可見，這兩批藥材12、13號峰的相對峰面積較大，相應化學成分相對含量較高。結合紫外吸收特征，得出這兩種成分均為香豆素類。這兩個相對含量較高的化學成分是否為藥效成分，尚需進一步研究。