藏悠游膠囊安全性毒理學評價及提高缺氧耐受力功能研究

張 娟，李水仙，王春芳，趙 巖，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101）

藏悠游膠囊是以葛根凍干粉、桔梗提取物、茯苓提取物、川芎提取物為主要原料制成的保健食品。《神農(nóng)本草經(jīng)》云：葛根“主消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒”[1]。《中國藥典》一部：桔梗止咳祛痰，用于痰濁阻肺所致的咳嗽痰多[2]。《世補齋醫(yī)書》中記載：“茯苓一味，為治痰主藥。痰之本，水也，茯苓可以行水；痰之動，濕也，茯苓又可以行濕”。《本草匯言》曰：“川芎，上行頭目，下調(diào)經(jīng)水，中開郁結，血中氣藥。味辛性陽，氣善走竄而無陰凝黏滯之態(tài)。雖入血分，又能去一切風，調(diào)一切氣”[1]。本研究按照《食品安全性毒理學評價程序》GB15193.1-2014的要求及其藥理活性，對藏悠游膠囊進行安全性毒理學評價及提高缺氧耐受力功能研究，為其作為保健食品的食用安全性及功效提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BP 211D電子天平（德國Sartorius公司）；高壓蒸汽滅菌器（日本SANYO公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，Stuart溫控搖床培養(yǎng)箱（英國Stuart公司）；BSC-1360ⅡA2生物安全柜（北京中聯(lián)哈爾）；AL204電子天平（Mettler）；全自動生化分析儀（日立）；ADVIA?2120i血液分析儀（西門子）；ASP200s全自動全封閉脫水機，EG1150 H & C 包埋機，RM2245半自動輪轉式切片機，HI1210攤片機，HI1220烤片機，XL全自動染色機，CV5030 全自動封片機（Leica）；BX51生物顯微鏡（Olympus）。

1.2 受試物

藏悠游膠囊，規(guī)格：360 mg/粒，36粒/瓶，內(nèi)容物為棕黃色，由某保健品有限公司生產(chǎn)。食用量為每日3次，每次3粒（360 mg/粒）；保存條件：置陰涼干燥處，避免陽光直照。

1.3 試劑

哺乳動物微粒體酶（S9），批號：3516，誘導劑及動物品種：多氯聯(lián)苯（Aroclor 1254）誘導雄性SD大鼠（上海寶錄）；敵克松（Dexon，批號：10112926，上海晶純）；注射用絲裂霉素（MMC，批號：131101，浙江海正藥業(yè)）；2-氨基芴（批號：13152，上海晶純）；1, 8-二羥基蒽醌（批號：WXBB7902V，美國Sigma-Aldrich公司）；環(huán)磷酰胺（批號：SLBG4216V，美國Sigma-Aldrich公司）；鈉石灰[批號：20031220，中國醫(yī)藥（集團）上海化學試劑公司]；亞硝酸鈉（批號：C1305006，阿拉丁公司）。

1.4 試驗動物及菌株

SPF級ICR小鼠，SPF級SD大鼠，均購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2014 0007。飼養(yǎng)條件：SPF級動物實驗室，實驗室使用許可證號：SYXK（魯）2018 0013。溫度：20～25 ℃，日溫差≤3 ℃，濕度：40 %～70 %，換氣次數(shù)：≥10次/h。照明時間：12 h 明暗交替。SPF大小鼠生長繁殖飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司），飼料生產(chǎn)許可證號：京飼證（2014）06054；實驗動物（飼料）生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0010。鼠傷寒沙門菌TA97a，TA98，TA100，TA102（上海寶錄）。

2 方法

2.1 急性毒性試驗

小鼠檢疫合格后，取試驗用小鼠20只，雌雄各半，體重，雄性20.0～22.0 g，雌性18.8～21.4 g。采用最大耐受劑量（MTD）法進行試驗。禁食不禁水16 h后，稱取樣品粉末25.0 g，充分研磨，加0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液至25 ml，制成1.0 g/ml的混懸液，經(jīng)口灌胃給予濃度為1.0 g/ml的受試物20 ml/kg BW。連續(xù)觀察14 d，記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，試驗結束后進行剖檢并記錄大體解剖結果。根據(jù)急性毒性劑量分級標準評價受試物的急性毒性強弱。

2.2 Ames試驗

實驗采用平板摻入法。受試物分為5000，1000，200，40，8 μg/皿5個劑量組。稱取1.25 g藏悠游膠囊內(nèi)容物，加滅菌注射用水至25 ml，混勻，制成5 %的混懸液（高劑量），0.103 MPa條件下滅菌20 min。將冷凍保存的試驗菌株TA97a，TA98，TA100，TA102分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 ml，37 ℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10 h。將含0.5 mmol/L組氨酸-0.5 mmol/L生物素的頂層培養(yǎng)基2.0 ml分裝于試管中，50 ℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1 ml，受試物溶液0.1 ml和S9混合液0.5 ml（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾倒于底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置，待冷凝固化后，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱里孵育48 h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。在加與不加S9混合液的條件下，受試物每個劑量均做3個平行板，同時設空白對照組（自發(fā)回變組）、溶媒對照組（滅菌注射用水）和陽性對照組。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

取試驗用小鼠50只，雄性小鼠25.1～28.1 g，雌性小鼠25.0～28.7 g，隨機區(qū)組法分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗設置受試物低、中、高劑量（2.5，5，10 g/kg BW）組、溶媒（0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液）對照組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW）對照組，各組小鼠均經(jīng)口灌胃給予，采用30 h兩次給予法，即兩次給予間隔24 h，第二次給予后6 h取材。首次給予時稱量動物體重并記錄。頸椎脫臼法處死小鼠，取胸骨，用止血鉗擠出骨髓液與載玻片一端的胎牛血清混勻，常規(guī)涂片。空氣干燥后，用甲醇固定10 min，將固定好的涂片放入Giemsa應用液中，染色10 min，用水輕輕沖洗，晾干。光學顯微鏡下，觀察200個嗜多染紅細胞（PCE），同時計數(shù)正染紅細胞（NCE），計算PCE/NCE比值，每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞。觀察含有微核的嗜多染紅細胞數(shù)，微核率以千分率表示。

2.4 小鼠精子畸形試驗

取試驗用小鼠25只，雄性，體重25.3～28.0 g，隨機區(qū)組法分為5組，每組5只。試驗設置受試物低、中、高劑量（2.5，5，10 g/kg BW）組、溶媒（0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液）對照組和陽性（環(huán)磷酰胺40 mg/kg BW）對照組。首次給予受試物后的第35天，頸椎脫臼法處死小鼠，取出兩側附睪，放入盛有約1 ml生理鹽水的小燒杯中，用眼科剪縱向剪1～2刀，靜止5 min，輕輕搖動。用4層擦鏡紙過濾，濾液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定5 min，晾干后用1 %伊紅染色1 h，用水輕輕沖洗，干燥。在低倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的部位，用高倍鏡檢查精子的形態(tài)。精子畸形按無鉤、香蕉形、胖頭、無定形、雙頭、雙尾、尾折疊進行記錄。每只動物檢查1000個精子。記錄畸變的類型和數(shù)量，計算精子畸形率。

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗

動物檢疫合格后，取SD大鼠80只，雄性體重68.8～84.3 g、雌性體重65.1～79.6 g，雌雄分別隨機分為4組，每組20只，雌雄各半。設低、中、高3個劑量組，劑量分別為1.35，2.7，5.4 g/kg BW（分別相當于人可能攝入量的25倍、50倍、100倍），大鼠摻入飼料量按10 g/100g BW計，摻入比例分別為1.35 %，2.7 %，5.4 %。采用逐級放大法將受試物摻入飼料中，見表1。對照組動物給予普通飼料。單籠飼養(yǎng)，自由飲食，連續(xù)喂養(yǎng)30 d。每周稱一次體重和兩次攝食量，計算每周及總的食物利用率。第31天在禁食16 h后，稱取禁食動物體重（空腹體重）后，戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動脈取血，進行血常規(guī)和血液生化測定，解剖動物并取材進行病理檢查。

表1 受試物摻入飼料法飼料制備表

2.6 提高缺氧耐受力功能試驗

2.6.1 分組及受試物給予方式 取小鼠120只，雄性，體重18～22 g，按體重隨機分為3組，分別進行常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗、急性腦缺血性缺氧實驗。每組40只，各分為溶媒對照組和受試物低、中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量分別為270，540，1620 mg/kg BW，相當于人體推薦量的5倍、10倍、30倍，用0.5 %的羧甲基纖維素鈉溶液配制受試物。灌胃體積20 ml/kg BW，低、中、高劑量組的受試物濃度分別為13.5，81 mg/ml。同時設溶媒對照組，灌胃給予同等體積的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。每天灌胃1次，連續(xù)給予30 d后，開始測定各項缺氧指標。

2.6.2 常壓耐缺氧實驗 末次灌胃后1 h，將各組小鼠分別放入盛有5 g鈉石灰的250 ml磨口瓶內(nèi)，每瓶1只，用凡士林封瓶口，蓋嚴，使之不漏氣，立即計時，以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。

2.6.3 亞硝酸鈉中毒存活實驗 末次灌胃后1 h，各組小鼠腹腔注射240 mg/kg BW的亞硝酸鈉，注射劑量0.1 ml/10 g BW，立即計時，記錄動物存活時間。

2.6.4 急性腦缺血性缺氧實驗 末次灌胃后1 h，各組小鼠自頸部逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時間。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理[4]

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，以±s表示，微核率和精子畸形率使用χ2檢驗進行分析，其他各指標均使用單因素方差分析（ANOVA）進行分析。

3 結果與分析

3.1 急性毒性試驗結果

小鼠一日內(nèi)經(jīng)口灌胃給予受試物20.0 g/kg BW，結果顯示，小鼠飲食活動正常，生長良好，未見明顯中毒表現(xiàn)及死亡情況，大體剖解未見明顯的異常表現(xiàn)，該受試物對兩種性別小鼠的MTD均大于20.0 g/kg BW。根據(jù)急性毒性分級標準，該受試物屬無毒級保健食品，結果見表2。

表2 藏悠游膠囊小鼠急性毒性試驗結果

3.2 Ames試驗結果

兩次試驗中受試物各劑量組在加和不加S9條件下各菌株回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，各劑量組間亦無劑量反應關系，表明在加與不加S9條件下，受試物對鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 4株菌株均未出現(xiàn)遺傳毒性。結果見表3、表4。

3.3 骨髓微核試驗結果

受試物各劑量組PCE/NCE比值不少于溶媒對照組的20 %，表明受試物對小鼠骨髓細胞未見明顯毒性。受試物各劑量組微核率與溶媒對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），環(huán)磷酰胺陽性對照組與溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明受試物無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用，小鼠骨髓微核試驗結果為陰性，結果見表5。

表3 Ames試驗結果（第1次試驗）

表4 Ames試驗結果（第2次試驗）

表5 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

3.4 小鼠精子畸形試驗結果

受試物各劑量組小鼠精子畸形率與溶媒對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），環(huán)磷酰胺陽性對照組與溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，受試物對小鼠精子畸形試驗結果為陰性，結果見表6。

3.5 30 d喂養(yǎng)試驗結果

3.5.1 對大鼠體重、攝食量及食物利用率的影響

3.5.1.1 對大鼠體重的影響 雌性動物高劑量組第3周和第4周體重、體重增重、總增重低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），結果見表7，表8。

表8 藏悠游膠囊對大鼠每周增重及總增重的影響（n=10）

3.5.1.2 對大鼠攝食量的影響 受試物各劑量組大鼠給藥期間各周攝食量與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，受試物對大鼠各周攝食量無影響。結果見表9。

3.5.1.3 對大鼠食物利用率的影響 雄性動物高劑量組第4周食物利用率和總食物利用率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。雌性動物中劑量組第3周食物利用率和總食物利用率，高劑量組第3周和第4周食物利用率、總食物利用率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05），結果見表10。

受試物對動物體重和食物利用率的影響可能與受試物主要成分的功效有關，本品主要成分為葛根提取物、桔梗提取物、茯苓提取物、川芎提取物，據(jù)文獻報道葛根具有降血脂的作用[5]，桔梗具有降血脂和抗肥胖的作用[6-7]，茯苓具有利尿作用[8-9]。

3.5.2 對大鼠血液學指標的影響 與對照組比較，雄性動物低劑量組中性粒細胞百分比升高，淋巴細胞百分比降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但上述檢測指標均在正常值范圍內(nèi)，不認為存在生物學意義。其他各劑量組動物各血液生化學指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表11。

3.5.3 對大鼠血清生化學指標的影響 雄性動物中劑量組總蛋白、血清白蛋白高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；雌性動物低劑量組谷草轉氨酶高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但均在正常值范圍內(nèi)，不認為存在生物學意義。其他各劑量組各血清生化指標與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表12。

3.5.4 病理學大體解剖觀察檢查 各劑量組大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胃腸、睪丸和卵巢大體解剖檢查均未見異常，各臟器組織病理學檢查未發(fā)現(xiàn)與受試物相關的組織病理學改變。雌雄動物各劑量組臟器濕重及臟器系數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表13、表14。

表9 藏悠游膠囊對大鼠每周攝食量的影響（n=10）

表10 藏悠游膠囊對大鼠每周及總的食物利用率的影響（n=10）

表11 藏悠游膠囊對大鼠血液學指標的影響（n=10）

表12 藏悠游膠囊對大鼠血清生化學指標的影響（n=10）

3.6 提高缺氧耐受力功能試驗結果

3.6.1 臧悠游膠囊對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響 結果見表15。由表15可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對照組比較，存活時間明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

3.6.2 高反靈牌藏悠游膠囊對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響 結果見表16。由表16可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的高反靈牌藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對照組比較，中劑量組存活時間延長，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即藏悠游膠囊小鼠亞硝酸鈉中毒存活實驗結果陽性。

3.6.3 藏悠游膠囊對小鼠急性腦缺血性缺氧喘氣時間的影響 結果見表17。由表17可見，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的藏悠游膠囊30 d，各劑量組與溶媒對照組比較，喘氣時間均延長，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

4 結論

本研究采用小鼠急性毒性試驗、Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、30 d喂養(yǎng)試驗5個方面對藏悠游膠囊進行安全毒理學評價，采用常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗、急性腦缺血性缺氧實驗研究其提高缺氧耐受力的功能。安全毒理學評價結果顯示，兩種性別小鼠MTD均大于20.0 g/kg BW，該受試物屬無毒級，Ames試驗、骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗3項遺傳毒性試驗結果均為陰性，30 d喂養(yǎng)未見明顯毒性作用。常壓耐缺氧實驗中，各劑量組均能延長小鼠常壓耐缺氧存活時間；亞硝酸鈉中毒存活實驗中，中劑量組能延長小鼠存活時間；急性腦缺血性缺氧實驗中，各劑量組均能延長小鼠的喘氣時間，3項試驗均為陽性。根據(jù)《食品安全性毒理學評價程序》GB15193.1-2014[3]，藏悠游膠囊未見明顯毒性作用且具有提高缺氧耐受力功能的作用。

表13 藏悠游膠囊對大鼠臟器濕重的影響（n=10）

表14 藏悠游膠囊對大鼠臟器系數(shù)的影響（n=10）

表15 高反靈牌藏悠游膠囊對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響

表16 藏悠游膠囊對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時間的影響

表17 藏悠游膠囊對小鼠急性腦缺血性缺氧喘氣時間的影響