食品微生物檢驗檢測方法研究進展

摘 要：隨著科技的迅速發展，尤其是生物學技術方面，我國的食品檢驗技術也逐步從傳統培養轉入分子等先進技術方向。本文就近些年新的技術方法的概念、原理、特點進行闡述，為建立食品微生物更高效的檢驗檢測系統奠定基礎。

關鍵詞：食品微生物；檢驗檢測；分子生物學技術

如今，信息科技的發展，不僅便利了生活，也讓人們面對的問題越來越多，比如三聚氰胺奶粉案。食品的安全問題已成為現在人們關注的焦點，做好食品安全檢測尤為重要。而在食品檢驗檢測中，通常微生物的檢驗過程是尤為繁雜的。由于微生物的種類繁多，每一種微生物的生存環境不一樣，這給檢驗工作帶來很大壓力。目前，已有很多省時省力的檢測方法出現，下面就對現在微生物檢測的前沿技術進行闡述。

1 分子生物學技術

1.1 PCR技術

PCR是一種擴增DNA片段的分子技術，由于菌體中的一些基因保守性很強，因此可擴增其相應的保守序列，來準確、快速地檢測菌體。具有操作便捷、檢測快捷、準確率高、靈敏度高與目標特異性強的特點，在微生物檢驗檢測過程中得以廣泛應用。目前該方法已被應用在乳制品中雙歧桿菌、乳酸菌及酵母菌的檢測中，且能對沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀桿菌、單核細胞李斯特菌與金黃色葡萄球菌等致病菌進行有效測定[1]。

PCR技術還可與新技術結合，形成新的PCR衍生技術。例如，qRTPCR、Multiplex PCR以及PCR-DGGE和LAMP等。其中，qRT-PCR，即實時熒光PCR技術，相對于傳統的PCR技術而言，具有更強的特異性、更高的自動化程度，且不易污染，近年來已在多種致病細菌、霉菌、酵母菌母以及乳酸菌等重要食品微生物指標的定性和定量檢測中廣泛應用。PCRDGGE，則是PCR與變性梯度凝膠電泳分析技術相結合，形成的一項新技術方法。該方法是通過選擇電泳條件，根據DNA片段中的堿基差異區分微生物。該技術可用于不可培養型細菌的檢測，具有高檢測率以及高重復性特點，目前該項技術已被廣泛應用在發酵類食品以及酒類等的檢驗和研究中。Multiplex PCR多被應用在食品病原微生物檢測中，其中可檢測出肉類中沙門菌、單核細胞增生李斯特菌和大腸桿菌O157∶H7[2]。LAMP利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈的合成，結果在同一鏈會形成有很多環的結構的莖—環DNA混合物，反應結果可直接靠擴增副產物焦磷酸鎂的沉淀濁度進行判斷。在大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌與金黃色葡萄球菌中已有廣泛應用[3]。

1.2 基因芯片

基因芯片技術是將帶有寡核苷酸的芯片與樣品DNA經PCR擴增后制備的熒光標記探針雜交，通過掃描儀分析熒光分布模式來確定樣品中是否存在特異微生物，具有檢驗范圍廣、操作快速、特異性強的特點，有廣泛的應用前景。例如，何洋[4]建立了一種利用基因芯片快速檢測鑒定食品中金黃色葡萄球菌的技術，過程僅需7 h，且實用性、特異性和穩定性很強。

1.3 核酸探針

核酸探針是指帶有標記的特異DNA片段，通過堿基互補與目的DNA雜交，再用特定的方法測定標記物，來判斷特異性微生物是否存在。該方法包含放射性標記、非放射性標記。放射性標記核酸探針的特異性非常強；而非放射性標記的類型多，有熒光素標記、生物素標記、免疫標記與地高辛標記等，具有直觀、準確等特點。核酸探針技術主要用于食品中致病性病原菌的檢測。例如，生物素-抗生物素蛋白系統標記的探針[5]已在沙門氏菌、產腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中應用。

2 免疫學技術

2.1 免疫熒光

免疫熒光技術是在特異性抗體（或抗原）上標記熒光色素，然后與待檢樣品中微生物的相應抗原（或抗體）結合，通過熒光顯微鏡檢測特異性熒光反應，以達到檢測相應微生物的目的。該技術的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。目前，可用來對沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E-Coli O157和單核細胞增生李斯特氏菌等進行快速檢測[6]。

2.2 酶聯免疫

酶聯免疫吸附技術是通過固相載體將抗原或抗體吸附于表面，而后進行免疫酶染色，再進行底物顯色，通過定性或定量分析有色產物即可確定樣品中是否存在特異微生物。該方法具有反應靈敏、標記物穩定、適用范圍廣、結果判斷準確以及費用低等特點。例如，王靜[7]等利用其檢測腸出血性大腸桿菌，可在40 min內完成。

酶聯免疫結合免疫熒光技術形成一種新的檢測技術叫酶聯熒光免疫檢測，該方法大大提高了檢測效率。例如，陳思強[8]等采用自動酶聯熒光免疫分析系統對凍肉中沙門氏菌進行檢測，大大提高了檢驗效率。

2.3 免疫層析

免疫層析是將待測物與條狀纖維膜上一定區域的配體結合，通過毛細管使樣品在條狀纖維膜上泳動，而后進行酶促顯色反應或直接使用著色標記物，以達到檢測特異微生物的目的。按原理可分為兩類，一類以酶促反應顯色為基礎，以顯色度來定量；另一類則使用著色標記物如乳膠顆粒、膠體硒、膠體金以及脂質體等進行檢測。例如，杜邦的大腸桿菌O157： H7、沙門氏菌、李斯特菌等檢測試紙條，檢測金黃色葡萄球菌的Aureus Test試劑盒都是基于免疫層析技術的產品。

2.4 免疫磁珠

免疫磁珠法是在磁性顆粒表面偶聯特異性抗體，并與樣品中被檢微生物中的特定抗原發生特異性結合，通過磁場作用于載有微生物的磁性顆粒，使微生物可得到特異性分離、濃集。該方法使食品檢測更加快速、高效，且具有可重復性。據報道，可以通過該種技術來完成對大腸桿菌0111、0145、0157以及沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的檢測和鑒定。

2.5 免疫擴散

免疫擴散是指特異性抗原與相應抗體在瓊脂介質中擴散、結合，在適當比例處形成沉淀線，根據沉淀線生物有無、形狀、位置等進行抗原（抗體）定性及定量分析。其介質多種多樣，例如瓊脂、明膠、果膠與聚丙烯酰胺等，適用范圍廣，目前廣泛應用于病原微生物檢測中。

2.6 免疫印跡

免疫印跡是根據抗原抗體特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白（特有的），能夠對特異性抗原（抗體）進行定性、定量分析。該技術融合了SDSPAGE的高分辨率及酶聯免疫技術的高敏感性和高特異性，是一種準確、高效的分析手段，已被廣泛應用于檢測酵母、真菌及疾病的診斷中。

3 生理生化技術

3.1 傳統代謝組學技術

3.1.1 電阻抗法

由于微生物在生長過程中可代謝導電性弱的大分子底物，使之變成導電性強的小分子底物，使培養基的電導性增強，培養物的阻抗降低，形成特征性阻抗曲線，電阻抗法即利用這一特性達到鑒定微生物的目的。該方法具有特異性、快速反應性、高敏感性和高重復性等特點。目前，該法已被廣泛應用于食品中細菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母菌和商業無菌的檢測[9]。

3.1.2 微熱量計法

微生物在生長過程中會產生熱量，利用微熱量計測量特征性微生物的產熱量等特異性數據，繪制成時間與產熱量對比組成的熱曲線圖，將所有特征性微生物的熱曲圖綜合后形成圖庫。待測微生物的熱曲線圖與已知細菌熱曲線圖直觀比較，即可對微生物進行鑒別。該方法操作便捷、檢測效率高、應用范圍廣。例如，美國TA公司的TAM Ⅲ系統就是基于該原理對菌體進行鑒別的。

3.1.3 微量生化法

微量生化法是通過對菌體生長過程中生化特性變化的檢測，以鑒定菌體。該方法具有簡單、快速、可靠等特點。目前已有多種高精密度和高重現性的微生物鑒定用試劑盒，例如，MICRO-ID可用于檢測李斯特氏菌；API用其獨特的數值鑒定法可鑒定15個系列、600多種細菌。

3.1.4 放射測量技術

放射測量技術是將培養基中的碳水化合物或鹽類等底物分子，引入放射性14C標記，通過微生物代謝碳水化合物或底物后，釋放出含放射性的14CO2，再用自動化放射測定儀測量14CO2的含量，以達到檢測微生物的目的。該方法具有快速、準確等優點。在測定食品中的細菌得以廣泛應用，如常用的Bactec MGIT 960系統[10]。

3.1.5 接觸酶測量技術

接觸酶測量是在裝有H202的試管中，放置一個含有接觸酶的紙盤，通過計算紙盤漂浮的時間來對微生物進行合理預估。紙盤上浮時間短，說明接觸酶含量高；反之，接觸酶含量低。自然界中大多數腐敗微生物是嗜冷性細菌，而大多數嗜冷細菌的接觸酶呈陽性，因此該方法可以應用于檢測食品中的腐敗微生物。

3.1.6 快速酶觸反應技術

快速酶觸反應技術是根據特異性微生物在生長繁殖過程中可合成或釋放特異性酶的原理進行檢測，選用與特異性酶的特性相適應的底物或指示劑進行反應，以此鑒定微生物。該方法應用范圍較廣。例如，Biolog微生物鑒定系統[11]是根據微生物對95種不同碳源代謝率的特異性差別，并與標準菌株對比進行鑒定。

3.2 生物傳感器技術

3.2.1 光學傳感器

光學傳感器是在培養基中預加指示劑后，微生物代謝的特異性產物與指示劑反應后，會使培養基顏色發生變化，這種顏色變化再由光學檢測器檢測、計算，得出特征性數據，以達到檢測微生物的目的。這種方法簡便、快速、成本較低，但只適用于檢測能產生熒光素的細菌，且靈敏度不高。例如，梅里BacT/Alert微生物檢測儀、NHD公司的手持式大腸類細菌快速檢測系統和BioLumix公司的實時微生物快速熒光光電檢測儀，都是基于此原理進行檢測的。

3.2.2 生物發光傳感器

ATP生物發光法是由生物體內的ATP和熒光素酶催化熒光素與氧結合，熒光素分子中的電子躍遷發出熒光，而在一定范圍內，熒光濃度與ATP濃度呈線性關系，可通過光度計對熒光素的熒光強度來檢測菌體的數量。從應用實踐來看，該技術具有省時、簡便性，多應用在大量食品樣本的檢測、現場檢測等領域。自動ATP生物熒光技術已廣泛應用于乳制品工業中，如生乳活菌數檢測、設備清潔度的評估及成品架售期的推算等。

3.2.3 電化學傳感器

電化學傳感器是微生物通過利用低電導率的大分子物質進行新陳代謝，生成高電導率的小分子物質，使培養基的電導率發生變化，再以電信號的變化檢測微生物。此技術特點是成本低，效率高。該技術被廣泛應用于食品微生物檢測，例如，微生物自動快速檢測系Bac- Trac4300，在檢測中沒有出現假陰性結果。

3.2.4 免疫傳感器

免疫傳感器是結合免疫學與傳感器的新技術，在結構上由生物敏感元件、信號轉換器和信號數據處理器3部分構成。當待測微生物的特異性分子與識別元件特異性結合后，產生的復合物可通過信號轉換器轉變為可以輸出的電信號或光信號，并通過信號數據處理器進行分析，以達到檢測的目的。該方法應用范圍較廣。據報道，采用電化學免疫傳感器技術檢測大腸桿菌O157∶H7，可以在10 min內完成[12]。

4 快速測試片

快速測試片是將特定的培養基和顯色物質附著在紙片、紙膜、膠片等載體上，通過微生物的生長過程中產生的特異性產物、并顯出特異性顏色來檢測食品中微生物。該方法具有顯著的優點：操作簡便，易于保存、運輸，減少對環境的污染、試驗前準備工作以及試驗后的清洗工作。近年來以濾紙、美國3M公司的Petrifilm和無紡布為載體的測試片，在檢測菌落總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌等菌體時，具有操作簡便且檢出率較高的特點，且與傳統方法相比在統計學上無顯著差異，現已開始被廣泛應用[13]。

5 分析化學技術

現已有很多儀器分析方法，如高效液相色譜、氣相色譜、氣相色譜-質譜儀以及液相色譜-質譜儀等，在食品微生物檢測鑒定中廣泛應用[14]。這些方法是通過分析微生物的化學組分進行鑒定的，是一種新型微生物檢測手段。目前，應用和研究最多的是氣相色譜技術。該方法首先是通過微生物裂解；其次，用甲醇分解、提取化學組分；再進行硅烷化、甲基化等衍生化處理，使特異性化學組分分離，并進行數據分析、建立標準色譜圖庫，將待鑒定微生物譜圖與標準譜圖相比較，來鑒定微生物[15]。該技術可應用于海產品腐敗菌的快速檢驗、革蘭氏陽性菌的檢測、發酵型食品的菌種檢驗、動物源雙歧桿菌亞種的分類鑒定等[16]。

6 結語

目前我國食品安全問題較為突出，而控制食品安全的首要措施是提高監測手段，因此，快速篩查技術在未來會有良好的研究價值和應用前景。而微生物快速篩查技術經過了長期探究及發展，已經進入快速、靈敏且儀器化的發展階段。但是，由于我國對該技術的研究起步晚、發展速度慢，該技術水平急需提升。各類學科技術的相互交叉、融合，以及降低先進技術的成本是未來科研工作者的研究重點。

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作者簡介：宋爽（1990—），女，山東德州人，碩士。研究方向：食品微生物。