HPLC-DAD法同時檢測餅干中10種合成色素

李世娟 王延龍 齊偉杰

摘 要：建立了食品中10種合成色素（檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、赤蘚紅與酸性橙Ⅱ）的高效液相色譜法。本法定量檢出限為：0.4～0.6 mg/kg，10種色素在1～20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均高于0.999，加標(biāo)回收率為88.4%～96.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83%～5.24%。本方法檢測簡便、快速、準(zhǔn)確、特異性強，非常適用于樣品數(shù)量大、檢測項目多的食品檢測機構(gòu)。

關(guān)鍵詞：HPLC-DAD；合成色素；食品

目前，檢測合成色素的國標(biāo)方法有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、微柱色譜法等，但大多數(shù)方法僅能同時檢測少數(shù)幾種色素。因此，針對基層食品檢測實驗室人員少，樣品種類多，檢測項目復(fù)雜，工作量大的現(xiàn)狀，研究出了能同時檢測食品中的10種常見人工合成色素的方法，能夠大大縮減檢測周期、減低檢測成本、提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜儀U-3000配DAD檢測器（美國Thermo Fisher Scientific公司）；C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，Diamonsil Plus公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-20M低溫離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純），乙酸銨（色譜純），屈臣氏超純水。

石油醚、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氨水、乙醇均為分析純。

乙酸銨溶液（10 mmol/L）：0.77 g乙酸銨加水溶解定容至1 000 mL，并超聲10 min。

乙醇-氨溶液： 取1 mL氨水，加入到100 mL 70%乙醇中。

亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）：稱取106 g亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]加水至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（220 g/L）：稱取220 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀釋至1 000 mL。

1.3 樣品處理

稱取2.0 g粉碎后的樣品于15 mL離心管，加入8 mL乙醇-氨溶液，渦旋均勻后超聲提取10 min，加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1.0 mL，混勻后于5 000 r/min離心5 min，取適量上清液過0.22 μm濾膜，上機。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL與20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進行液相分析，以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度進行線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的確定

實驗發(fā)現(xiàn)，水相中乙酸銨的濃度在10～20 mmol/L范圍內(nèi)時，各組分均有較好的分離效果，但在梯度洗脫條件下，高濃度的乙酸銨流動相在有機相比例波動較大的情況下混合析出結(jié)晶，從而降低色譜柱的使用壽命，因此，水相中乙酸銨的濃度設(shè)定為10 mmol/L。

2.1.2 柱溫的確定

考察了柱溫為25、30、35 ℃和40 ℃時各組分的分離效果，發(fā)現(xiàn)柱溫在此范圍內(nèi)均能有效分離，隨著溫度的升高，出峰時間略微縮短，但柱溫為30 ℃時各組分的峰形尖銳且分離度較好，因此選擇柱溫為 35 ℃。

2.1.3 檢測波長的確定

使用DAD檢測器對各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液在210～600 nm下進行光譜掃描，測得各組分最佳吸收波長分別為檸檬黃428 nm、新紅523 nm、莧菜紅534 nm、胭脂紅513 nm、日落黃494 nm、誘惑紅509 nm、亮藍595 nm、酸性紅512 nm、赤蘚紅529 nm以及酸性橙492 nm。再根據(jù)各組分出峰順序，發(fā)現(xiàn)部分組分在可見光區(qū)內(nèi)的最佳吸收波長范圍有重合，經(jīng)過多次優(yōu)化，設(shè)定出可見紫外檢測程序。見表1。

2.1.4 色譜圖

通過高效液相色譜分離，二極管陣列檢測器檢測，優(yōu)化色譜條件后10種人工合成色素得到有效分離，10種合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示，樣品在400～600 nm波長下無明顯雜質(zhì)干擾。

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取液的選擇

分別用去離子水，1%氨水和乙醇-氨溶液提取樣品，發(fā)現(xiàn)去離子水和1%氨水對赤蘚紅和酸性橙Ⅱ的提取率偏低，乙醇-氨溶液能用有效提取所有色素，同時具有一定的沉淀蛋白的作用。

2.2.2 沉淀劑的優(yōu)化

分別用0.5、1.0、1.5 mL與2.0 mL沉淀劑進行實驗，1.0 mL沉淀劑能夠有效去除樣品中蛋白，沉淀劑過多會使色素的回收率降低。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和檢測限

對混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在色譜條件下進行進樣分析，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

3倍信噪比時所對應(yīng)的濃度為出檢出限。

2.4 回收率及精密度實驗

分別稱取空白樣和加標(biāo)樣各2份，其中2份加標(biāo)樣分別加入100 μL濃度為1 mg/L的10種色素混標(biāo)溶液，按照1.3進行處理后上機檢測，結(jié)果取平均值，計算回收率。對其中一份加標(biāo)樣平行檢測6次，計算RSD值，相關(guān)結(jié)果見表3。

3 小結(jié)

本方法簡化了前處理步驟，不需要再進行固相萃取和濃縮步驟，大大縮短了前處理時間。采用絕大部分干擾物無響應(yīng)的400～600 nm的波長進行檢測，避免大部分食品添加劑和天然色素的干擾。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、快速、簡便、定量結(jié)果可靠，非常適合同時處理多批次樣品。