甲巰咪唑對初診Graves

姜麗莉 王靜 李振鳳 周齊 欒雪靜 任新雯

摘要：目的? 探討甲巰咪唑對初診Graves'病患者血清相關細胞因子及microRNAs（miRNAs）水平的影響。方法? 選取2016年12月～2019年1月于海陽市人民醫院內分泌科就診的36例Graves'病初診患者為疾病組，給予甲巰咪唑治療。另選取同期30例健康志愿者作為健康對照組。比較疾病組治療前、治療后及健康對照組甲狀腺功能指標[游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）]、細胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]的水平。結果? 疾病組治療前FT3、FT4，TRAb，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP，miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，TSH、IL-2及miR-146a水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。疾病組治療后FT3、FT4、TRAb、IL-6、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-142-3p、miR-155水平低于治療前，而TSH、IL-2、miR-146a水平高于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;IL-17水平治療前后比較，差異無統計學意義（P>0.05）。疾病組治療后TSH、IL-2、miR-146a水平低于健康對照組，IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-155水平高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組FT3、FT4、TRAb及miR-142-3p水平比較，差異無統計學意義表（P>0.05）。結論? 甲巰咪唑可改善Graves'病患者的甲狀腺功能，血清相關細胞因子及miRNAs可作為該病臨床診療的輔助指標。

關鍵詞：Graves'病;甲巰咪唑;細胞因子;microRNAs

中圖分類號：R511.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.08.031

文章編號：1006-1959（2020）08-0101-04

Abstract：Objective? ? To investigate the effect of methimazole on serum-related cytokines and microRNAs（miRNAs） in newly diagnosed Graves' disease patients.Methods? From December 2016 to January 2019，36 newly diagnosed patients with Graves' disease who were treated in the Department of Endocrinology of Haiyang People's Hospital were selected as the disease group and treated with thiamazole.Another 30 healthy volunteers in the same period were selected as the healthy control group.Comparision of thyroid function indexes before treatment ，after treatment of disease group and healthy control group[free triiodothyronine（FT3）， free thyroxine（FT4）， thyroid stimulating hormone（TSH），thyrotropin receptor antibody （TRAb）]，Cytokines [IL-2，IL-6，IL-17，TGF-β1]，hs-CRP，microRNAs[miR-16，miR-142-3p，miR-146a，miR-155].Results? Before treatment，the levels of FT3，FT4，TRAb，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were higher than those of healthy controls，TSH，IL- 2 and miR-146a levels were lower than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.After treatment，the levels of FT3，FT4TRAb，IL-6， TGF-β1，hs-CRP，miR-16，miR-142-3p，and miR-155 were lower than before treatment，the levels of TSH，IL-2 and miR-146a were higher than before treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）; the IL-17 level before and after treatment had no significant difference（P>0.05）. After treatment，the levels of TSH，IL-2，miR-146a in the disease group were lower than those in the healthy control group，IL-6，IL-17，TGF-β1，hs-CRP， miR-16，miR-155 were higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference in FT3，FT4，TRAb and miR-142-3p levels between the two groups（P>0.05）. Conclusion? Thiamazole can improve thyroid function in patients with Graves' disease.Serum-related cytokines and miRNAs can be used as auxiliary indicators for clinical diagnosis and treatment of this disease.

Key words：Graves' disease;Methimazole;Cytokines;microRNAs

Graves'病（graves' disease，GD），又稱毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種器官特異性自身免疫性疾病，是甲狀腺功能亢進癥最常見的類型，約占甲亢的85%。近年來GD發病率逐年升高，并呈現年輕化趨勢[1]。該病臨床主要表現為高代謝癥候群、彌漫性甲狀腺腫、眼征、皮損及脛前粘液性水腫。針對該病，目前主要治療方法包括抗甲狀腺藥物、放射性核素碘、手術及介入栓塞。其中以抗甲狀腺藥物療法最為安全方便，且治療過程中不會造成永久性甲減而得到廣泛應用。抗甲狀腺藥物中甲巰咪唑因安全性相對較好、藥效穩定、半衰期長、患者的依從性較好而被推薦作為臨床治療甲亢的首選藥物[2]。有研究表明，表觀遺傳、環境和免疫學因素在GD發病機制發病中起著重要作用，多種免疫細胞和細胞因子共同參與了GD的發病，尤其是T淋巴細胞及其相關細胞因子，如IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1[3]。除細胞因子外，miRNAs直接或間接參與了固有性及適應性免疫應答，從而可能在自身免疫性疾病的發生發展過程中發揮重要的負調控作用。越來越多的研究證實，miRNAs異常與GD的發生密切相關，研究較多的有miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155[4]。本研究通過檢測IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1等細胞因子、hs-CRP及miR-16、miR-142-3p、miR-146a 及miR-155等miRNAs的表達水平，觀察甲巰咪唑治療GD病的臨床效果，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料? 選取2016年12月～2019年1月于海陽市人民醫院內分泌科就診的36例Graves'病初診患者為疾病組，疾病組男性7例，女性29例;年齡19～68歲，平均年齡（38.41±11.81）歲，另選取同期30例健康志愿者為健康對照組，其中男性6例，女性24例;年齡18～60歲，平均年齡（39.06±11.17）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P>0.05）。疾病組患者均符合2008版《中國甲狀腺疾病治療指南》中GD病的診斷標準，無手術治療史及合并嚴重心肺功能不全。健康對照組無新近感染，且無甲狀腺疾病和家族史。所有研究對象均排除感染、妊娠、腫瘤、過敏性疾病以及其它免疫性疾病，6個月內均未使用激素及免疫抑制劑。所有參與者均簽署書面知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本收集? 所有研究對象均于清晨空腹采集肘部靜脈血5 ml，3000 r/min 離心10 min，分離血清并分裝，-80℃保存待測。

1.2.2甲狀腺功能相關指標測定? 采用BECKMAN COULTER UniCel DXI800全自動化學發光儀與配套試劑對所有研究對象進行FT3、FT4以及TSH定量測定。采用羅氏Cobas e411電化學發光全自動免疫分析儀與配套試劑對TRAb進行定量測定。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 hs-CRP測定? 采用免疫透射比濁法進行hs-CRP的檢測。選用BECKMAN COULTER AU5800全自動生化儀及伊普諾康生物試劑盒，檢測步驟參照說明書進行。

1.2.4細胞因子的測定 以 IL-2測定為例，應用Human IL-2 ELISA Kit（聯科生物）進行濃度定量測定，檢測方法為ELISA，檢測步驟參照說明書。繪制血清樣本標準曲線，使用Thermo Scientific multiskan go全波長酶標儀在450 nm及570 nm處進行雙波長吸光值測定并計算待測細胞因子濃度。IL-6、IL-17、TGF-β1檢測步驟同上。

1.2.5 miRNAs的測定? ①RNA提取：采用Trizol法提取血清樣本中的總RNA。取-80℃保存的血清200 μl，加1 ml Trizol混合均勻，提取過程參照說明書。提取的總RNA應用Nanodrop OneC超微量可見分光光度計檢測其在波長260 nm及280 nm 處的吸光度比值以驗證其純度。②逆轉錄及熒光定量PCR：將提取的總RNA進行逆轉錄，以U6為內參，反轉錄過程參照Takara PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）說明書，反應條件：42℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保存。熒光定量PCR按照QIAGEN QuantiNova? SYBR? Green PCR說明書進行，反應條件為95℃ 2 min，95℃ 5 sec，60℃ 10 sec，40個循環。

1.3觀察指標? 比較疾病組治療前、治療后及健康對照組甲狀腺功能指標[游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、促甲狀腺素受體抗體（TRAb）]、細胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]。

1.4統計學方法? 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用（n）表示，計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1甲狀腺功能指標水平? 疾病組治療前FT3、FT4，TRAb水平高于健康對照組，TSH水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后FT3、FT4以及TRAb水平低于治療前，TSH水平高于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后TSH水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩者FT3、FT4、及TRAb水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2血清細胞因子及hs-CRP水平? 疾病組治療前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康對照組，IL-2水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。疾病組治療后IL-2水平高于治療前，IL-6、TGF-β1、hs-CRP水平低于治療前，差別有統計學意義（P<0.05），治療前后IL-17水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）;疾病組治療后IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP水平高于健康對照組，IL-2水平低于健康對照組（P<0.05），見圖1。

2.3 miRNAs的表達水平? ?疾病組治療前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治療前，miR-146a水平高于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩者miR-142-3p水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。

3討論

目前，臨床上GD治療主要依據血清中甲狀腺激素水平的變化，然而后者的指示作用存在一定局限性。多項研究證明，細胞因子及miRNAs在GD發病過程中起著重要的調節及介導作用。故本文通過測定血清中細胞因子及miRNAs在甲巰咪唑治療前后表達水平的變化，探究其在GD診療中的作用。甲巰咪唑是目前臨床上治療GD的主要藥物之一，具有抑制甲狀腺腺泡內過氧化物酶、阻礙T3、T4合成及輕度的免疫抑制作用。本研究顯示，GD患者在經甲巰咪唑治療6個月后，FT3、FT4以及TRAb水平均低于治療前，而TSH水平高于治療前，說明甲巰咪唑可抑制甲狀腺激素的合成，改善患者的甲狀腺功能。

GD通常被認為與遺傳、外界環境變化以及自身免疫系統異常有關。免疫系統異常主要是免疫細胞及細胞因子失衡。IL-2水平增高通常可以提示某種自身免疫性疾病。IL-6可增加T細胞表達IL-2及IL-2受體（IL-2R），并參與刺激免疫反應的細胞增殖、分化及自身抗體產生[5]。IL-17是一種強大的前炎癥細胞因子，通過促進炎癥因子分泌將中性粒細胞招募至炎癥部位形成炎癥反應，并參與介導自身免疫性疾病的發生發展[6]。hs-CRP常作為炎性反應的一個重要指示[7]。本研究中，疾病組治療前IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP較健康對照組表達升高，IL-2降低，說明這些細胞因子可能參與了GD發生并促進其發展。治療后，IL-6、IL-17、TGF-β1及hs-CRP較治療前降低，IL-2升高，說明甲巰咪唑具有免疫抑制作用。而IL-17水平變化不明顯，這可能與甲巰咪唑不能抑制外周血中IL-17分泌有關。同時，GD患者治療后盡管甲狀腺功能回歸正常，但機體免疫失衡依舊存在。

大量研究表明，miRNAs在自身免疫疾病的發生中起關鍵作用，大多參與調節免疫細胞的分化或激活免疫反應，但其與GD相關的研究還很少[8]。miR-16可參與炎癥因子及趨化因子生成[9]，miR-142-3p削弱了調節性T細胞（Regulatory T cells，簡稱Tregs）對CD4+CD25T細胞增殖反應和細胞因子產生的抑制作用。既往文獻證實GD患者Treg細胞抑制功能受損[10]，說明miR-146a可能參與CD4+T細胞功能異常，進而影響炎癥發展[11]。miR-155被認為與天然免疫應答密切相關，其表達失調可引起炎癥及多種自身免疫性疾病。本研究中發現miR-16、miR-142-3p、miR-146a及miR-155表達水平在治療前后均發生了顯著變化，疾病組治療前miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-142-3p及miR-155水平低于治療前，miR-146a水平高于治療前，差異有統計學意義（P<0.05）;疾病組治療后miR-16、miR-155水平高于健康對照組，miR-146a水平低于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05），兩者miR-142-3p水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），說明上述miRNAs可能在GD的發生發展中發揮重要作用，可能通過損害GD患者的CD4+T細胞功能而加重免疫功能亢進。同時，甲巰咪唑治療后，miRNAs較治療前有顯著性差異，表明miRNAs可能是甲巰咪唑治療GD的作用機制之一。

綜上，甲巰咪唑可改善GD病患者的甲狀腺功能，血清相關細胞因子及miRNAs可作為GD病臨床診療的輔助指標。

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收稿日期：2020-03-03;修回日期：2020-03-17

編輯/李國苗