CNP、12/15-LOX基因多態性與早發冠心病關系的研究

路艷 郭紀文 徐曉輝 衛艷寧 朱彤 王琴麗

(西電集團醫院心內科，陜西 西安 710000)

冠心病(coronary artery disease，CAD)是全球主要致死、致殘疾病之一，嚴重威脅人類健康和患者生存質量[1]。隨著CAD發病年齡的日漸年輕化，人們又提出早發冠心病(premature coronary artery disease，PCAD)的概念，即CAD發生時男性≤55 歲，女性≤65 歲。遺傳學規律表明，疾病發生越早，與遺傳學關系越密切。CNP通過與細胞表面NPR-B及 NPR-C結合，分別激活GC-cGMP-PKGI通路、Gi-AC-cAMP-PLC通路以及MAPK級聯通路等發揮多種心血管生物調節功能[2-4]。CNP具有調節血管張力，抑制血小板、白細胞相互作用及活化，調節內皮、血管平滑肌增殖，抑制心肌細胞肥大等功能，進而參與動脈粥樣硬化、主動脈瓣鈣化、心室重構、支架內再狹窄以及缺血—再灌注損傷等多種心血管病理生理過程的調節[5-8]。12/15-LOX能夠參與到機體炎性反應的過程中，而冠心病患者冠狀動脈粥樣硬化的發生，同樣與血管內皮損傷及炎性反應有關[9-13]。本研究采用MALDI-TOF法，通過對CNP基因位點rs5262、12/15-LOX基因位點rs916055的單核酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的研究，進一步探討了CNP、12/15-LOX 基因多態性與PCAD遺傳易感性的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2017年4月至2018年4月我院心內科住院PCAD患者58例(男≤55歲，女≤65歲)作為實驗組，患者均符合冠心病診斷標準：經冠狀動脈造影證實至少1支主要冠狀動脈狹窄≥50%。入選62例非冠心病者作為對照組，經冠狀動脈造影排除CAD。排除標準：心肌病、先天性心臟病、嚴重肝臟和腎臟疾病。兩組患者年齡、性別等差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 iPLEX試劑盒；質譜檢測儀器；SpectroCHIP芯片；引物合成；DNA提取試劑盒等。

1.3研究方法 采晨空腹靜脈血4～5 mL，行相關實驗室指標檢測，余血EDTA抗凝，-80℃保存，用于后續SNP位點基因型鑒定。按DNA提取試劑盒操作步驟并檢測OD值(A260/A280)，A260/A280>1.8，則DNA純度合格。

1.4PCR-MALDI-TOF法檢測rs5262、rs916055位點的SNPs 使用MassARRAY Assay Design軟件和Sequenom公司Genotyping Tools對rs5262和rs2728121兩位點PCR擴增引物及單堿基延伸引物進行設計，引物詳細信息見表1。PCR擴增：94 ℃ 預變性4 min；94 ℃變性20 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，進行45個循環；最終72 ℃延伸3 min，4 ℃。PCR產物純化：采用兩種方式對溫度與時間進行了控制，當溫度為37 ℃時，應將純化的時間控制在20 min。隨著溫度的上升，純化時間可逐漸縮短。當溫度達到85 ℃時，僅純化5 min便可達到滿意的效果。單堿基延伸反應：首先將溫度設置為了94 ℃，該溫度下，反應30 s便可達到實驗所需要的效果。隨后，本研究在溫度不變的情況下，將反應時設置為了5 s，進一步對反應效果進行了觀察。質譜檢測：純化后置入在384孔SpectroCHIP芯片上，進行上機測定，使用MALDI-TOF技術對SpectroCHIP芯片進行分型檢測，結果使用Sequenom TYPER 4.0軟件分析。

表1 SNP分型引物序列

1.5統計學方法 應用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1一般臨床資料比較 實驗組男/女、年齡、膽固醇、低密度脂蛋白、體重指數、糖尿病與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，實驗組吸煙史、高血壓史、CAD家族史與對照組對比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 一般臨床資料的比較

2.2rs5262、rs916055位點基因型與等位基因在兩組的分布 rs5262位點、rs916055位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。實驗組與對照組rs5262位點存在A/A、A/G、G/G的三種基因型，差異有統計學意義(P<0.001)。我們推測，rs5262等位基因與PCAD發病無相關性。兩組rs916055位點基因型差異顯著(P<0.001)，實驗組A等位基因攜帶率高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，實驗組組AA+AG基因型頻率較高，我們認為，rs916055 中A等位基因，與疾病的發生存在一定的關系，見表3。為了排除吸煙史，高血壓病史和CAD家族史對多態位點與PCAD相關性之間相關性的影響，我們在調整了上述危險因素后，進一步進行了二項Logistic回歸分析，見表4。rs916055 位點A等位基因的OR(95%CI)為3.622(2.140～6.128，P<0.001)。

表3 rs5262、rs916055的基因型與等位基因頻率在實驗組和對照組的分布

2.3rs5262、rs916055位點PCR擴增產物質譜分析結果 見圖1～2。

表4 rs5262 G、rs916055 A等位基因與實驗組的Logistic回歸分析

圖1 rs5262 圖2 rs916055

3 討 論

CAD是一種威脅當今人類健康的常見疾病，目前被認為是由包括遺傳因素在內的復雜多因素疾病。隨著近年來CAD發病年青化傾向，提出了PCAD的概念。基因多態性是指在某個基因座上≥2個不同等位基因，基因的多態性逐漸成為了近年來冠心病危險因素研究的新領域。CNP是利鈉肽家族成員，由VEC合成，以自分泌和旁分泌的形式發揮調節局部血管張力，抑制血小板、白細胞活化，調節VEC、VSMC增殖，抑制心肌細胞肥大以及拮抗ET-1作用等多種生物學活性。推測其可能在動脈粥樣硬化、心室重構、支架內再狹窄以及缺血-再灌注損傷等多種心血管病理生理過程發揮重要作用[14-16]。12/15-LOX屬于脂氧合酶家族，有充分證據表明12/15-LOX參與動脈粥樣硬化的發展。12/15-LOX通過炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發展，國內外學者[9-13]已探索了12/15-LOX基因多態性與頸動脈粥樣硬化斑塊的關系，其結論并不完全一致。

本研究發現，實驗組與對照組rs5262位點存在A/A、A/G、G/G差異顯著(P<0.001)，表明三者與冠心病的發生之間，存在顯著的相關性，臨床應對該問題加以重視。從以上結果我們同樣可以推測，rs5262等位基因與PCAD發病無相關性。進一步觀察發現，兩組A基因型頻率相比差異具有統計學意義(P<0.001)，實驗組A基因型頻率較高為82.76%。通過對上述數據的觀察可以發現，rs916055 中A等位基因的存在，與PCAD的發生有關。臨床可通過檢測該基因，實現對冠心病發病風險的評估，并以之為基礎，對早發冠心病發病的地域性差異進行分析，為臨床對疾病的控制提供參考。

眾所周知，吸煙、高血壓和CAD遺傳史是PCAD發病的獨立危險因素。為了排除混雜因素對結果的影響，使用Logistic回歸分析來調整吸煙、高血壓和CAD遺傳史，調整后rs916055等位基因A仍是PCAD的危險因素(P<0.001)，即A等位基因PCAD的風險相對較高。該研究證實rs916055具有遺傳預測作為PCAD風險因素的潛力。

綜上所述，12/15-LOX基因位點rs916055的SNPs與陜西漢族人群PCAD的遺傳易感性有關，為預防和篩查PCAD提供了理論依據。