?莼菜中鋅蛋白的分離及初步分析?

?肖鶩軒 王昆侖 周海燕

摘 要：為了明確莼菜中鋅蛋白的分布及氨基酸組成，以富硒高鋅土壤中種植的莼菜為材料，對其幼葉蛋白質進行分離提取和分析。結果表明：莼菜中蛋白質主要類型為弱堿性蛋白質，比例為44.79%，但其鋅含量相對較低，水溶性蛋白比例只有15.43%，但其鋅含量卻是弱堿性蛋白質中的2.17倍，表明大部分鋅離子是與水溶性蛋白結合的;通過逐級鹽析從水溶性蛋白中獲得5個餾分，進一步分析各餾分的蛋白質含量及鋅含量，獲得WSⅡ和WSⅤ這2個高鋅含量的蛋白質餾分，電泳分析顯示這2個餾分分別由一個或一系列相同亞基組成;氨基酸組分分析顯示，WSⅡ和WSⅤ中甘氨酸、硒代半胱氨酸、組氨酸和賴氨酸含量較高。

關鍵詞：莼菜;鋅蛋白;分離;氨基酸組成

中圖分類號：Q513 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2020）04-0064-05

Preliminary Analysis and Separation of Zinc Protein in Brasenia schreberi

XIAO Wu-xuan1，WANG Kun-lun2，ZHOU Hai-yan2

（1. Hunan Institute of Nuclear Agriculture Science and Space Breeding， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC;

2. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： Brasenia schreberi planted in selenium-rich and high-zinc soil was used as the target material in this study. The proteins in Brasenia schreberi young leaves were separated and analyzed for further clarification of zinc protein distribution and amino acid composition in the genus. The results show that the main type of proteins in Brasenia schreberi is weak alkaline protein， accounting for 44.79%， but its zinc content is relatively low; the proportion of water-soluble protein is only 15.43%， but its zinc content is 2.17 times that of weak alkaline protein， which indicates that most of the zinc ions are combined with water-soluble protein. Five fractions from water-soluble protein were obtained by stepwise salting out， then the protein content and zinc content of each fraction were analyzed， finally two protein fractions of high zinc content WSⅡ and WSⅤ were obtained. Electrophoresis analysis shows that these two fractions are composed of one or a series of the same subunits. Amino acid composition analysis shows that the contents of glycine， selenocysteine， histidine and lysine are high in WSⅡ and WSⅤ.

Key words： Brasenia schreberi; zinc protein; separation; amino acid composition

莼菜（Brasenia schreberi）又名蒪菜、馬蹄菜、湖菜等，系睡蓮目睡蓮科莼屬植物。莼菜為須根系植物，不定根簇生于地下匍匐莖的莖節靠近葉柄基部的兩側;莖可分為3類，分別是匍匐莖、縮短莖和水中莖[1];幼葉葉片呈現卷曲狀態，且葉外有透明質膠包裹，可食用[2];花由花瓣、花托、花萼、花梗及雌雄蕊組成，花期為2 d，第一天呈現雌蕊的功能，第二天則是展現雄花的功能，白天花朵浮出水面，主要靠風媒傳播授粉，夜晚花體沉入水中，于水中授粉結果，2～6周種子即可成熟[3]。莼菜在亞洲廣泛栽培，可有性繁殖，也可無性繁殖。

莼菜的營養價值較高，富含可溶性植物多糖、蛋白質及一些微量元素。目前已經檢測到的微量元素多達27種，其中鋅元素的含量遠超一般蔬菜[4]。此外，莼菜還含有膳食纖維及維生素B等物質[4]，是一種應用前景廣闊的蔬菜。還有研究表明，莼菜提取物具有抗藻、抗菌和化感作用[5]。研究表明，莼菜多糖對小鼠的免疫系統具有明顯的改善作用[6-9]。

鋅是植物[10]、動物[11]和微生物[12]必不可少的微量元素，存在于數百種特定的酶中[13]。鋅通常在轉錄因子中充當結構離子[14]，并且通過金屬硫蛋白進行存儲和轉移[15]。對人類而言，鋅有著更為普遍的生物學功能[16]。它與多種有機配體相互作用[16]，并在RNA和DNA的代謝、信號轉導和基因表達中起作用，它還能調節細胞凋亡。除數百種參與交換和運輸鋅的蛋白質外，還約有10%的人類蛋白質可與鋅結合。大量文獻對莼菜葉片表層凝膠和多糖的結構和功能進行了闡述，但對莼菜中鋅和蛋白質的研究較少。前期研究表明，鋅在莼菜幼葉中的含量最高，并且與蛋白質結合的鋅含量高于與多糖或其他有機分子結合的鋅含量。因此，筆者以產自湖北省利川市（其耕地土壤富含鋅和硒元素）的莼菜為材料，對蛋白質進行分離提取和分析，以期進一步明確莼菜中鋅蛋白的含量、結構和功能。

根據參考文獻，用C18反相柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）分析了WSⅡ和WSⅤ中回收的富鋅蛋白質的氨基酸組成，結果如表1和圖5所示。從WSⅡ中回收的富鋅蛋白質由天冬氨酸（D）、甘氨酸（G）、組氨酸（H）、精氨酸（R）、脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、

纈氨酸（V）、半胱氨酸（C）、硒代半胱氨酸（Se-C）、賴氨酸（K）等組成;其中，甘氨酸、酪氨酸和賴氨酸的比例較高，占比為84.98%。此外，趨于與鋅結合的組氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、精氨酸和賴氨酸的比例也高達43.58%。從WSⅤ中回收的富鋅蛋白質由天冬氨酸（D）、甘氨酸（G）、組氨酸（H）、蘇氨酸（T）、丙氨酸（A）、脯氨酸（P）、酪氨酸（Y）、硒代半胱氨酸（Se-C）等組成;其中，甘氨酸、酪氨酸、組氨酸、丙氨酸和硒代半胱氨酸的比例較高，占比為95.79%，而傾向于與鋅結合的組氨酸和硒代半胱氨酸的比例為12.10%。

3 討 論

該研究所選莼菜材料種植在富含鋅元素的土壤中，因此其鋅含量較一般地區高，是一種理想的鋅補充劑。試驗結果表明，在該材料中，幼葉的鋅含量很高，且其傾向于與水溶性蛋白質結合。純化后發現，莼菜幼葉中2種鋅結合水溶性蛋白（WSⅡ和WSⅤ）分別由一個或一系列相同亞基組成。通過RT-HPLC的氨基酸分析，蛋白質WSⅡ和WSⅤ的甘氨酸、硒代半胱氨酸和組氨酸的含量高，另外WSⅡ中的賴氨酸含量也較高。在蛋白質中，鋅離子通常與天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和組氨酸的氨基酸側鏈配位[20]。因此，WSⅡ和WSⅤ的硒代半胱氨酸和組氨酸含量很高也就不足為奇了。硒代半胱氨酸替代半胱氨酸的原因是莼菜生長的土壤中硒元素含量較高。這些結果表明，生長在湖北利川地區的莼菜由于其高鋅含量及豐富的氨基酸組成而具有良好的營養品質，具有較好的開發

前景。

參考文獻：

[1] 覃章輝，皮秀權，陳銀花，等. 利川莼菜休眠芽形態特征及形成原因探究[J]. 長江蔬菜，2020（2）：29-31.

[2] 孫雨欣，毛水芳，陳銀寧，等. 莼菜體外膠的分離及其體外功能活性研究[J]. 食品與發酵工業，2020，46（2）：55-60.

[3] 王昌全，李煥秀，彭國華，等. 土壤及水質條件與莼菜生長的關系[J]. 四川農業大學學報，2000，18（3）：265-268.

[4] 余正平，謝 淋，龍 瓊，等. 莼菜綜合應用價值研究進展[J]. 貴州農機化，2019（3）：6-9，28.

[5] Elakovich S D，Wooten J W. An examination of the phytotoxicity of the water shield，Brasenia schreberi[J]. Journal of Chemical Ecology，1987，13（9）：1935-1940.

[6] 李京凌，滕 左，韓 芳，等. 四大產區商品莼菜多糖組成及抗氧化活性分析[J]. 食品與發酵工業，2020，46（1）：262-268.

[7] 寧 可. 莼菜多糖提取分離、結構鑒定及抗氧化研究[D]. 杭州：浙江工業大學，2019.

[8] 崔 杰，何正有，屠銀芳，等. 莼菜多糖的分離、純化及結構初步研究[J]. 中成藥，2018，40（4）：990-993.

[9] Wang S R，Xia E N，Zhou L. Extraction，isolation and some biological activities of polysaccharide of Brasenia Schreberi[J]. Journal of China Pharmaceutical University，1987，18（3）：187-189.

[10] Broadley M R，White P J，Hammond J P，et al. Zinc in plants[J]. New Phytologist，2007，173（4）：677-702.

[11] Prasad A S. Zinc in human health：effect of zinc on immune cells[J]. Molecular Medicine，2008，14（5/6）：353-357.

[12] Sugarman B. Zinc and infection[J]. Clinical Infectious Diseases，1983，5 （1）：137-147.

[13] United States National Research Council，Institute of Medicine. Dietary reference intakes for vitamin A，vitamin K，arsenic，boron，chromium，copper，iodine，iron，manganese，molybdenum，mickel，silicon，vanadium，and zinc[M]. Washington，D.C.：National Academies Press，2001.

[14] Andreini C，Bertini I，Cavallaro G，et al. Metal ions in biological catalysis：from enzyme databases to general principles[J]. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry，2008，13（8）：1205-1218.

[15] Cotton F A，Wilkinson S G，Murillo C A，et al. Advanced inorganic chemistry （6th editon）[M]. New York：John Wiley & Sons，1999 .

[16] Hambidge K M，Krebs N F. Zinc deficiency：a special challenge[J]. The Journal of Nutrition， 2007，137（4）：1101-1105.

[17] Walker J M. The protein protocols handbook（2nd editon）[M]. New Jersey：Humana Press. 2002

[18] Da-Col J A，Domene S M A，Pereira-Filho E R. Fast determination of Cd，Fe，Pb，and Zn in food using AAS[J]. Food Analytical Methods，2009，2（2）：110-115.

[19] Marshak D R，Kadonaga J T，Burgess R R，et al. Strategies for protein purification and characterization：A laboratory course manual[M]. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.

[20] Brandt E G，Hellgren M，Brinck T，et al. Molecular dynamics study of zinc binding to cysteines in a peptide mimic of the alcohol dehydrogenase structural zinc site[J]. Physical Chemistry Chemical Physics. 2009，11（6）：975-983.

（責任編輯：成 平）