佛山地區無精子癥及嚴重少精子癥患者Y 染色體微缺失基因分析

吳智剛 李煒煊 李啟欣 李小藍

不育是現有衛生疾病中較為常見的一種類型,嚴重影響到世界各國的人口增長。遺傳因素導致男性不育中Y 染色體微缺失占據主要地位［1,2］。其中,位于Y 染色體長臂遠側端的無精子因子(Azoospermia factors,AZF)區域出現缺失是遺傳學導致男子生精障礙的主要因素。但現階段對Y 染色體AZF 區域基因微缺失情況,仍未獲得相對明確的數據［3］。本研究中選取嚴重少精子癥、無精子癥患者作為研究對象,并選取50 例精液參數正常的男性作為對照進行研究,旨在分析Y 染色體長臂微缺失對嚴重性少精子癥以及無精子癥男性不育患者的影響以及相關性,為臨床男性生精障礙不育患者的治療奠定醫學基礎,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1～9 月本院泌尿科門診接治的300 例原發性男性不育患者作為研究對象,按照疾病分型不同分為嚴重少精子癥組(200 例)及無精子癥組(100 例),同時選取50 例可正常產生精子的男性作為正常組。本研究已通過本院醫學倫理委員會審核準許。所有研究對象均簽署知情同意書。納入標準：經臨床診斷及精液檢查后確診為嚴重少精子癥或無精子癥者；無精神障礙,具備良好的溝通能力。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 所有研究對象均提取2 份5 ml骨髓或者外周血,利用肝素進行抗凝全血后,分別用于核型分析以及全血DNA 提取［4］。

1.2.2 染色體核型 取一份血液樣本加入5 ml 含小牛血清的培養液,充分混勻后置于37℃條件下的培養箱中進行孵育,持續3 d 后按照常規操作進行染色體標本制備,進行G 顯帶,在油鏡下對100 個淋巴細胞進行分析。

1.2.3 外周血基因組DNA 提取 根據Axygen biosciences 公司提供的方法步驟將另一份血液標本進行外周血粒細胞基因組DNA 提取。

1.2.4 Y 染色體微缺失檢測 選取位于Y 染色體長臂AZFa 區、AZFb 區、AZFc 區、AZFd 區各兩個位點進行檢測,各區域的位點依次為sY86、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、SY152、SY153,采用多重聚合酶鏈反應結合Taqman 技術,檢測研究對象DNA 中AZF 微缺失,同時以鋅指蛋白基因(ZFX/ZFY,SY238)和睪丸決定因子(SRY)作為內參照。

1.2.5 PCR 擴增及檢測 外周血基因組DNA 模板采用梯度聚合酶鏈式反應(PCR)儀進行PCR 擴增反應,采用2%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行水平電泳,應用凝膠成像分析系統對PCR 產物進行分析。

1.2.6 精液質量檢測 所有研究對象需進行精液檢測,禁欲3～7 d 到院檢查,手淫取精2～6 ml,7 d 后復查,取兩次平均值［5］。

1.3 觀察指標 比較三組的Y 染色體長臂區微缺失情況、正常組與嚴重少精子癥組的精子密度和精子活力(a 級精子、a+b 級精子)。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組Y 染色體長臂區微缺失情況對比 嚴重少精子癥組、無精子癥組AZF 區缺失率分別為11.50%、22.00%,均明顯高于正常組的4.00%,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 正常組與嚴重少精子癥組的精子密度和精子活力對比 正常組的精子密度(32.72±14.37)×106/ml 高于嚴重少精子癥組的(15.06±13.27)×106/ml,精子活力中a 級、a+b 級精子分別為(24.87±6.51)%、(41.38±11.04)%均高于嚴重少精子癥組的(12.48±6.86)%、(29.56±14.96)%,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1 三組Y 染色體長臂區微缺失情況對比［n(%)］

表2 正常組與嚴重少精子癥組的精子密度和精子活力對比()

表2 正常組與嚴重少精子癥組的精子密度和精子活力對比()

注：與正常組對比,aP＜0.05

3 討論

世界衛生組織進行一項關于不孕不育夫婦不孕原因的調查,結果顯示近15%的不孕不育夫婦中近一半是因男性原因導致［6］。而引發男性不育癥的主要原因中接近1/3 是因先天性遺傳異常導致精子生成障礙,進而引發不孕不育。AZF 區域的基因缺失情況存在一定差異,AZF 區域中的任何基因出現微缺失均可造成男子生精障礙的疾病問題。

李翠等［7］研究指出當男性患者出現AZFa 區缺失時,其臨床表現主要為支持細胞綜合征,若缺失基因位于AZFb 區域,則會表現為精子生成障礙,患者的精子在精母細胞階段停止發育,最為常見的缺失類型為AZFc 缺失,相應誘發的臨床癥狀為少精子癥。亐開興等［8］研究指出患有唯支持細胞綜合征的患者,在出現無精子癥狀的同時會出現AZFb、AZFc 區域部分缺失以及AZFa 區完全缺失的情況,若存在以上情況即使采用經皮穿刺附睪抽吸取精術、睪丸精子穿刺獲取精子的幾率也非常小［9］。本項研究采用多重PCR 技術對200 例嚴重少精子癥患者、100 例無精子癥患者、50 例無生精障礙的男性進行研究對比,分析其Y 染色體長臂AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd 區的缺失情況,結果顯示嚴重少精子癥組、無精子癥組AZF 區缺失率分別為11.50%、22.00%,均明顯高于正常組的4.00%,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與以上結論相符。本研究中,正常組的精子密度高于嚴重少精子癥組,精子活力中a 級、a+b 級精子均高于嚴重少精子癥組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。證實AZF 區域確實影響男子的精子生成,進而降低男性的精液質量,引發不育。包毅剛等［10］研究后得出一致結論。

綜上所述,及時到院檢測Y 染色體長臂AZF 區微缺失情況可從基因角度明確生精障礙原因,有利于相應治療措施的制定,減少醫療支出,有效避免藥物、手術治療對身體造成的損傷,緩解子代遺傳缺陷負荷,為優生優育提供可靠的依據,值得臨床推廣。