PPARγ 基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性研究

晏昆 蒙凌 陳玉芳

動脈粥樣硬化性腦梗死是一種常見且頻繁發生的疾病,嚴重威脅著人類健康。調查研究顯示［1］,大多數動脈粥樣硬化性腦梗死的病理基礎都是由于動脈粥樣硬化。已經發現PPARγ 基因與很多慢性疾病有關,例如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病、糖尿病等。PPARγ 基因在動脈粥樣硬化形成的病理過程起著很大的影響。現在,除了高血壓和糖尿病等動脈粥樣硬化性腦梗死的原因,遺傳因素也成為了一個危險因素。所以,本研究的主要是研究基因和分子水平上的PPARγ 基因與動脈粥樣硬化性腦梗死之間的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣州新海醫院2017 年10 月～2018 年12 月收治的100 例經CT/MRI 檢查有低密度梗死區且血脂生化指標顯示有異常的患者設為實驗組,100 例體檢或因周圍神經病變等入院行頭顱MRI 未發現腦梗死病變的患者設為對照組。實驗組高血壓55 例,22 例糖尿病；對照組高血壓22 例,糖尿病8 例。所有研究對象均簽署了知情同意書。兩組年齡、性別、體質量指數(BMI)、吸煙等一般資料比較,差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較(,n)

表1 兩組一般資料比較(,n)

注：兩組比較,P＞0.05

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 ①缺血性中風的診斷標準符合中國腦血管疾病學術會議確診的診斷標準；②中風后24～48 h 內到本院神經內科就診；③在第1 次或第2 次中風之前沒有腦血管狹窄的病史；④病變血管中有［2］：a.顱前循環血管。大腦中動脈M1 段和頸內動脈、前腦動脈A1 段、前交通動脈等；b.后顱循環血管。例如：后交通動脈和腦后動脈P1 節段、椎基底動脈。

1.2.2 排除標準 ①在2 周內服用過葉酸或B 族維生素；②肝腎功能嚴重衰竭；③近一段時間使用過免疫抑制劑,例如甲氨蝶呤、雌激素、節育藥、抗凝劑、炎性抑制劑、抗癲癇藥(如苯妥英鈉、卡馬西平)；④非動脈粥樣硬化性血管狹窄。

1.3 方法 選擇兩個SNP 位點rs1875796(Hha I 位點,SNP1)和rs1699337(Hinf I 位點,SNP2),以通過限制性酶片段多態性去檢測SNP 的基因型。①提取基因組DNA 通過DNA 提取試劑盒(Promega)的方法。②PCR反應：使用Primer5.0 軟件設計引物。SNP1 位點上游引物：5'-GTGGCTATCTTTGCTG-TTTG-3'；下游引物：5'-ACCAAGTGTCRRCCTCCTG-3'；SNP2 上游引 物：5'-TRCTFGACCACCGAGCT-3'；下游引物：5'-CTCTGCGTAGCTGATTGGA-C-3'。PCR 反應體系為25 μl,包括25 μl 雙蒸餾水,10 mmol Tris-HC1(pH 8.3),50 mmol KC1,1.5 mmol MgC12,4 種dNTP 各200μmol,引物各0.4 μmol,TaqDNA 聚合酶(Promega)1.0 U,基因組DNA 30～50 ng。PCR 反應條件：在94℃預變性5 min,在94℃變性45 s,在55℃變性1 min,在72℃延展1 min 35 個循環,在72℃延伸10 min。③酶消化系統：PCR產物用限制性內切核酸酶(Promega)消化。在37℃水浴中4～6 h,在凝膠成像系統(上海培清科技有限公司)下用2%瓊脂糖凝膠電泳(90 mV)30～40 min 后觀察結果［3］。

1.4 觀察指標 檢查兩組生化指標(TG、CHOL、LDL-C、HDL-C),分析基因多態性。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。多組比較采用編秩后單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni 校正法。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組生化指標比較 實驗組TG、CHOL、LDL-C均高于對照組,HDL-C 低于對照組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組生化指標比較(,mmol/L)

表2 兩組生化指標比較(,mmol/L)

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2 基因多態性

2.2.1 PPARγC161T 本實驗PCR 擴增的目的基因片斷長度為200 bp。當堿基C 突變為T 后,不能被限制性內切酶EcoR72I 識別,故TT 純合型因酶切位點消失,酶切電泳后僅見200 bp 1 條帶；CC 型為野生純合型,是常見基因型,可被酶切為120 bp、80 bp 2 條帶；CT為突變雜合型,酶切后可見200 bp、120 bp、80 bp 3 條帶。

2.2.2 PPARβ+294T/C 本實驗PCR 擴增的目的基因片段長度為269 bp。當堿基T 突變為C 后,可被限制性核酸內切酶BSLI 識別并酶切,故可見突變純合子CC 型被切為167 bp 和102 bp 2 個電泳條帶；而TT野生純合型無酶切位點,是常見基因型,酶切電泳后僅見269 bp 1 條帶；CT 型為突變雜合型,電泳后產生269 bp、167 bp、102 bp 3 個電泳條帶。

3 討論

動脈粥樣硬化性腦梗死的大多數基本病變是由于動脈粥樣硬化,在動脈粥樣硬化的形成中PPARγ 基因扮演著重要的角色,所以動脈粥樣硬化性腦梗死的潛在候選基因很有可能就是PPARγ 基因［4］。

PPAR 基因是編碼60kD 的蛋白,位于人類染色體3 號染色體(3p25)的短臂上。目前,關于腦梗死與PPARγ 基因之間關系的研究很少。有學者證實腦梗死和PPARγ 基因2 號外顯子Prol2Ala 錯義突變沒有明顯的關系［1］。即使是進化上最古老的常見多態性中最微小的有害突變在人類進化中很難遺留下來,而且許多和疾病相關遺傳標記的非編碼區或基因功能都在未知的區域。所以選擇位于第5 內含子的rs1699337位點和位于第4 內含子的rs1875796 位點AS 基因標記來研究AS 腦梗死和PPARγ 基因之間的關系。PPARγ 在脂肪組織以及小腸和脾臟中高表達。通過對基因轉錄的協同作用,認為PPAR 途徑對于脂肪細胞分化,胰島素樣作用和脂肪代謝都起著很大的重要性。研究調查顯示,激活PPARγ 具有抗動脈粥樣硬化的抗炎作用,通過對平滑肌細胞增殖和遷移的遺址,來起到內皮素-Ⅰ和Ⅰ纖溶酶激活劑的表達作用的遺址,使得血管舒張,血纖蛋白的形成的較少,血栓形成的遺址。PPARγ 基因進程的不斷發展,要就PPARγ基因進程的已發展到了到神經系統疾病,但是大多數研究都在實驗動物和受體激動劑上。再灌注腦缺血后,腦組織會有顯著的炎癥反應,導致腦缺血后的第二次損傷的發生［5］PPARγ 激動劑抑制炎癥介質的產生時通過抑制炎癥信號的方法來抑制炎癥反應。相關的炎癥信號傳導途徑包括激活蛋白-1(AP-1),NF-kB,活化T 細胞核因子(NFAT),JAK-STAT 等。

綜上所述,在動脈粥樣硬化的形成中PPARγ 基因扮演著重要的角色,動脈粥樣硬化性腦梗死的潛在候選基因很有可能就是PPARγ 基因。