CHB 感染者經替諾福韋聯合胸腺肽治療后miR-122 和miR-21表達的研究

梁爽，張寶*，李世龍，吳丹，牛蕊，邸寶春，王輝

（1.唐山市傳染病醫院,河北 唐山；2.唐 山 市人民 醫 院檢驗科,河北 唐山）

0 引言

慢性乙肝是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的一種嚴重危害人體健康的傳染病，其臨床特點為病程長、反復發作，并可進一步發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌（HCC）。據資料統計，我國慢性HBV 感染者約9000 萬例，其中CHB 患者約2800 萬例[1]。目前，最主要的方法是抗病毒治療，但無論是干擾素或是核苷(酸)類似物的治療，只能抑制HBV-DNA 復制，不能徹底根治CHB，療效有限[2]。本研究的目的是通過替諾福韋聯合胸腺肽治療慢性乙型肝炎，觀察臨床療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2017 年10 月至2019 年3 月于我院收治且符合以下納入和排除標準的96 例CHB 患者，采用隨機數表法分為對照組和觀察組，每組48 例。對照組患者中男性25 例，女性23 例，年齡19～60 歲，平均(39.45±8.51)歲，病程2～26 年，平均(11.3±2.2)年。觀察組患者中男性28 例，女性20 例；年齡21～58 歲，平均(38.81±7.91)歲，病程3～18 年，平均(6.12±5.51)年。兩組患者的一般資料比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準

符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年更新版)》[3]診斷標準進行診斷。

1.3 納入與排除標準

①納入標準：所有入選者均為已確定診斷的CHB 患者；血清HBsAg、HBeAg 均陽性，HBV-DNA 大于106至107copies/mL；未服用抗病毒類藥物及免疫調節的時間大于6 個月；經過醫院倫理委員會批準，自愿簽署知情同意書，加入本治療方案。②排除標準：重疊其他肝炎病毒感染及肝硬化、肝癌者；合并惡性腫瘤者；嚴重的心腦血管疾病、嚴重精神障礙患者及糖尿病、酗酒、腎功能障礙者；妊娠期及哺乳期婦女。

1.4 治療方法

兩組患者均給予常規保肝及對癥治療。在此基礎上，觀察組患者給予替諾福韋 （TDF）（生產廠家：葛蘭素史克；進口注冊證號H20130589），口服，每天1 片，每次300mg，空腹服用，同時給予胸腺肽腸溶片（生產廠家：黑龍江喜人藥業集團有限公司；國藥準字H20063310）口服，每天3 次，每次10mg。對照組患者給予替諾福韋口服，每天1 片，每次300mg，空腹服用。

1.5 觀察指標

①采用全自動分析儀（7080 型，日立HITACHI 公司），試劑由寧波美康生物科技有限公司提供，檢測肝功能指標：血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉移酶（GGT）、總膽紅素(TBil)；②HBV 標記物：HBeAg 采用酶聯免疫吸附法檢測，HBV-DNA 定量采用熒光定量PCR 法檢測，采用ABI PRISM7300RT-PCR 檢 測 儀（美 國）進 行 定 量 檢 測（試 劑：中山大學達安基因股份有限公司）；③T 淋巴細胞亞群檢測：采用流式細胞儀（艾森生物有限公司）檢測患者外周血CD45+、CD45+CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+等細胞絕對計數和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值；④血清miR-122、miR-21 檢測：PCR 熱循環儀為德國Eppendorf 公司、實時熒光定量測定PCR 儀為美國Applied Biosystems 公司，特異性莖環逆轉錄引物由生工生物工程（上海）有限公司提供，RNA 提取試劑盒及熒光定量PCR 檢測試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。用RT-PCR 法檢測血清miR-122、miR-21 的表達，采用U6 作為內參照PCR 的相對測定方法，均以2-△△Ct法計算miR-122、miR-21 相對表達量，ΔΔCt ＝待測樣本的ΔCt-對照樣本ΔCt，ΔCt ＝目的基因Ct 值-內參基因Ct 值。Ct 值為每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。

1.6 統計學方法

應用Graphpad Prism8.0 統計軟件進行數據分析和繪制圖形，計量資料用均值±標準差表示，采用t 檢驗,計數資料率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療后肝功能指標變化情況

觀察組治療后ALT、AST、GGT、TBil 較對照組明顯改善，差異有統計學意義(P 均＜0.05)；觀察組治療后HBeAg 陰轉率和HBVDNA 應答率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P 均＜0.05)。詳見表1。

表1 觀察組和對照組CHB 感染者治療后肝功能和免疫學指標情況(n=48,

表1 觀察組和對照組CHB 感染者治療后肝功能和免疫學指標情況(n=48,

組別 ALT(U/L) AST(U/L) GGT(U/L) TBiL(umol/L) HBeAg 轉陰率(%) HBV-DNA 轉陰率(%)觀察組 34.8±22.4 43.5±18.6 68.5±31.3 27.3±13.2 20（41.67） 39（81.25）對照組 51.9±21.7 60.3±23.1 89.3±43.6 46.8±19.2 11（22.92） 25（52.08）t 值/χ2 值 3.7987 3.9246 2.6850 5.7983 3.8589 9.1876 P 值 0.0003 0.0002 0.0086 0.0000 0.0495 0.0024

2.2 兩組患者治療后免疫功能指標變化情況

觀察組治療后CD45+,CD45+CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+細胞絕對計數明顯較對照組改善，差異有統計學意義(t=4.2443，P=0.0 0 0 1；t=7.3 1 4 8，P=0.0 0 0 0；t=3.6 2 2 2，P=0.0 0 0 5；t=3.4420，P=0.0009，P 均＜0.05)，觀 察 組 治 療 后CD3+CD4+/CD3+CD8+(1.83±1.05)較對照組(1.21±0.95)升高，差異有統計學意義(t=3.0336，P=0.0031＜0.05)，詳見圖1。

圖1 觀察組與對照組治療后的T 細胞亞群絕對計數分布

2.3 兩組患者治療后血清中miR-122、miR-21 表達水平的變化情況

觀察組治療后，血清中miR-122、miR-21 表達水平較對照組明顯下降，兩組間差異有統計學意義(t=2.3878，P=0.0189； t=2.9198，P=0.0044。P 均＜0.05)，詳見圖2。

圖2 觀察組與對照組治療前后的miR-122、miR-21 表達情況

3 討論

慢性乙型肝炎是我國臨床上常見的、高發的傳染病，目前研究認為其發病機制主要是持續復制的高病毒載量和免疫介導的非特異性免疫應答損傷[4-5]及特異性T 淋巴細胞功能耗竭、凋亡[6]所致的肝細胞損傷及炎癥發生。因此，在抑制CHB 復制的同時調節免疫是較理想的治療方法。替諾福韋為一種單磷酸腺苷類似物，經水解、磷酸化產生替諾福韋二磷酸，參與病毒DNA 整合，阻礙病毒DNA 延長，從而抑制HBV 復制[7]。據研究資料顯示，替諾福韋能快速、有效控制乙肝病毒，無論是在HBV-DNA 的陰轉、HBeAg轉換方面，還是在安全性、耐藥性方面均優于其它核苷（酸）類似藥物，并且還能有效延緩肝硬化進展及降低肝癌的發生率，改善病情，提高生活質量，為慢性乙型肝炎的首選藥物[8-9]。胸腺肽能調節免疫，促進T 淋巴細胞成熟，誘導T 淋巴細胞亞群發育和成熟，增強巨噬細胞吞噬能力，提高白介素n 產生水平與受體表達水平，增加CD4+、CD8+T 淋巴細胞數量[10-11]，從而調節和增強機體的細胞免疫功能，增強機體抵抗力，二者聯合應用治療CHB 患者可提高療效。本研究對96 例CHB 患者在替諾福韋治療基礎上給予胸腺肽治療，并以單獨采用替諾福韋治療進行對照，結果顯示：治療后觀察組肝功能指標（ALT、AST、GGT、Tbil）、BeAg陰轉率、HBV-DNA 水平及免疫功能指標(CD45+、CD45+CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+)與對照組比較顯著改善(P＜0.05)。表明替諾福韋聯合胸腺肽治療能提高CHB 患者的臨床效果。

miRNA 是一類內源性長度由20～25 個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，能夠調節mRNA 的表達[12]。在慢性HBV 感染者中，miR-122、miR-21 血清含量的表達，可作為肝組織損傷的標志物，具有良好的敏感性和特異性[13-14]。并有研究發現，miR-122、miR-21 高表達及其表達水平與肝硬化及HCC 患者的臨床分期、分化程度密切相關[15]。這說明miR-122、miR-21 的表達在乙肝病毒的復制、肝細胞的損傷和疾病的進展中可能起著重要作用。研究結果顯示治療后, 觀察組miR-122、miR-21 的表達水平顯著下降 ,與治療前和對照組均有統計學差異 (P＜0.05)。提示替諾福韋聯合胸腺肽治療可以降低CHB 患者血清中miR-122、miR-21的表達水平，從而減輕肝臟的炎癥損傷，降低肝癌的發生率，并有助于疾病進展的評估與風險預測。

綜上所述，替諾福韋聯合胸腺肽治療CHB 患者能有效促進肝功能恢復,抑制HBV-DNA 復制，提高HBeAg 陰轉率，增強機體免疫力，降低血清中miR-122、miR-21 的表達水平，改善肝臟炎癥損傷及降低肝癌的發生率，尤其是在以HBV 基因型C 基因型為主的唐山地區[16]具有積極的臨床意義。