多殺性巴氏桿菌NarQ-NarP信號傳導系統的作用初探

【摘 要】目的 本研究旨在探究血清A型多殺性巴氏桿菌中NarQ-NarP雙組份信號轉導系統是否具有調控硝酸鹽代謝的作用。方法 用硝酸鹽還原實驗檢測多殺性巴氏桿菌是否具有還原硝酸鹽的能力;然后將血清A型多殺性巴氏桿菌在含有不同濃度硝酸鹽的培養基上培養，提取培養液總RNA，用實時熒光定量法測定narQ、narP在轉錄水平的表達量，并用相對定量分析法比較了多殺性巴氏桿菌NarQ-NarP雙組分系統在不同硝酸鹽濃度下基因轉錄水平的變化。結果 不同濃度硝酸鹽對narQ、narP的表達量均產生了不同程度的影響。結論 血清A型多殺性巴氏桿菌的NarQ-NarP雙組分系統與硝酸鹽的代謝密切相關。

【關鍵詞】多殺性巴氏桿菌;NarQ-NarP;硝酸鹽

巴氏桿菌是一種廣泛分布于世界各地的細菌，由巴斯德氏在1880年首先自病雞分離得到。巴氏桿菌病是一種由巴氏桿菌屬細菌引起的一種急性、熱性、畜禽共患的傳染病，危害極大。而引起該病的主要病原體細菌就是其中的多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida），也是本屬中對畜禽的危害中表現最為嚴重的一種，同時該菌也能感染人類，因此一直受到社會的廣泛關注[1]。

細菌的生存離不開信號轉導，雙組份系統是廣泛存在于細菌中的一種信號轉導體系，在大腸桿菌中第一次被發現，后續大量的研究表明該系統對細菌的生長、分化、代謝、繁殖等都有不同程度的調控作用[2]。但是在目前已有的研究中，有關巴氏桿菌的雙組份信號轉導研究很少。前期基因組測序及數據庫比對顯示，巴氏桿菌中存在著多組雙組份系統，且存在著與大腸桿菌結構類似的能夠調控硝酸鹽代謝的NarQ-NarP二元雙組份信號轉導系統。本研究先用硝酸鹽還原實驗明確了牛源A型多殺巴氏桿菌具有還原硝酸鹽的能力，然后在巴氏桿菌培養基中添加不同濃度硝酸鹽，在此基礎上檢測該多殺性巴氏桿菌的NarQ-NarP雙組份信號轉導系統的兩個構成元件narQ、narP在轉錄水平上的變化，研究結果表明該信號系統與環境中硝酸鹽濃度變化具有密切關系。

1 材料與方法

1.1 材料

重慶某奶牛場分離得到的牛源A型多殺性巴氏桿菌血清強毒株。

1.2 主要試劑

①生物工程有限公司生產的narQ、narP引物

②Invitrogen公司生產的16s引物

③硝酸鹽還原生化管

④馬丁氏肉湯

⑤康為世紀公司的Ultrapure RNA Kit（超純RNA提取試劑盒）、HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit（HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒）

⑥BIO-RAD公司的SsoFast EvaGreen Supermix及Optical Flate 8-Cap Strips for 0.2ml tube strips

1.3 試驗方法

1.3.1 硝酸鹽還原實驗

將培養的牛源A多殺性巴氏桿菌接種于硝酸鹽還原生化管中，置于37℃恒溫培養箱中培養24小時或以上，同時以一支接種等量滅菌生理鹽水的培養基做空白對照。

1.3.2 不同濃度硝酸鹽和亞硝酸鹽培養基的配制

在配制好的馬丁肉湯中分別添加終濃度為0g、0.25g、0.5g、0.75g、1.0g、1.25g、1.5g的硝酸鹽，每個培養基中后續提取的總RNA樣品分別標記為0、1、2、3、4、5、6號樣品。

1.3.3 RNA的提取

按Ultrapure RNA Kit操作步驟提取細菌培養液中總RNA，并用核酸檢測儀測定每個樣品所提取的總RNA濃度和純度。

1.3.4 反轉錄

按康為世紀公司的HiFiScript Quick gDNA Removal cDNA Kit操作步驟去除基因組DNA（反應體系見表F1，反應條件42℃孵育2min），并對RNA進行反轉錄（反應體系見表F2，反應條件42℃孵育15min，85℃孵育5min，然后-20℃保存）。

1.3.5 熒光定量PCR

①選擇多殺性巴氏桿菌16s為內參糾正上樣量的誤差。

②RT-PCR 反應體系如下表F3：

③樣品：為了保證實驗的準確性，每個不同硝酸鹽濃度下樣品的每一個基因（narQ、narP、16s）設置了3個重復數。

④熒光定量PCR，約1.5h。

1.3.6 相對定量法

該法用來分析熒光定量PCR數據，即通過Cq值來確定目的基因的表達差異倍數，Cq值是指擴增過程中熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數。該方法假定目的基因和內參的表達為1，當相對表達倍數大于1時，表示處理后的樣品該基因表達量增加，反之，則表達量減少。

2 結果

2.1 硝酸鹽還原試驗

硝酸鹽還原試驗中，試驗生化管中的液體變為紅色，呈陽性反應;空白對照管的結果呈陰性，液體顏色無任何變化。結果如下圖J1。

2.2 RNA的提取

各提取樣品RNA濃度測定結果見表J1。

2.3 熒光定量PCR

各樣品的熒光定量PCR的平均Cq值見表J2。

根據熒光定量PCR相對定量法計算公式，由以上編號1的樣品narP基因計算公式為：

根據以上計算方法，將narP、narQ在不同硝酸鹽濃度培養基中的相對表達倍數呈現于表J3中。

由表J3做柱形圖如下（圖J2）：

3 討論

3.1 多殺性巴氏桿菌硝酸鹽還原能力的測定

某些細菌能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與α-萘胺結合生成N-α萘胺偶苯磺酸，呈現紅色[4]。在實驗中，生化管中液體呈現紅色，為陽性，故該牛源A型多殺性巴氏桿菌具有還原硝酸鹽的能力。

3.2 不同濃度硝酸鹽條件下narQ、narP基因表達量的測定

由圖J2可以看出，在不同濃度硝酸鹽培養基中，narQ、narP基因的表達量隨硝酸鹽濃度的不同而改變。當環境中硝酸鹽濃度在0.75-1.25 g/L時，narQ、narP基因的表達量處于一個較低水平，這可能是多殺性巴氏桿菌比較適應的硝酸鹽濃度范圍;當環境中硝酸鹽濃度過高或過低時，narQ、narP基因的表達量均開始上升，以此調控環境中太高或太低的硝酸鹽濃度，使細菌通過雙組分信號轉導系統來適應變化了的環境，這與原榮榮等報道的在大腸桿菌中NarQ-NarP信號系統具有調控下游與硝酸鹽相關的基因 的功能相一致[5]。圖J2還表明，narQ、narP這對雙組分元件在不同濃度的硝酸鹽環境中，其上調或下降表達的趨勢是一致的，說明這兩個元件在多殺性巴氏桿菌的生長、代謝過程的作用是相輔相成、共同作用，這與堯可等報道的典型的雙組份信號系統通常包括組氨酸激酶和反應調節蛋白，這兩個蛋白憑借其特殊的結構域同時發揮接受磷酸基團和調節下游分子的作用機制相一致[6]。

3.3 結論

牛源A型多殺性巴氏桿菌具有硝酸鹽代謝的能力，在硝酸鹽代謝的過程中，該菌的NarQ-NarP雙組份信號轉導系統與硝酸鹽代謝密切相關。

參考文獻：

[1]高娃，林靖凱.豬巴氏桿菌病[J].國外畜牧學（豬與禽），2014，34（1）：14-26.

[2]米國華，賴寧薇，陳范駿，等.細菌、真菌及植物氮營養信號研究進展[N].植物營養與肥料學報，2008，5（14）：1008-1016.

[3]康永凱，賈永義.熒光定量PCR數據處理方法的探討[J].生物技術，2008，3（18）：89-91.

[4]胡桂學，陳金頂，彭遠義. 獸醫微生物學實驗教程[M]. 第2版. 中國農業大學出版社，2015.

[5]原榮榮，夏遠.大腸桿菌信號轉導系統研究進展[J].綠色科技，2013-6（6）：310-314.

[6]堯可，蔡靖儀，趙蕾等.牙齦卟啉單胞菌雙組分信號轉導系統的研究進展[J]. 華西口腔醫學雜志，2021-39（01）：88-93.

作者簡介：

黃蘭香（1972-），女（漢族），湖南常德人，博士，任職于西南大學動物醫學院，副教授，研究方向：主要從事動物微生物學與免疫學的教學科研工作。

基金項目：

1.重慶市基礎與前沿研究計劃項目（cstc2015jcyjA80021），項目名稱：牛A型巴氏桿菌NarQ-NarP調控系統缺失株的構建及其生物學特性研究;

2.西南大學基本科研業務費專項資金項目（XDJK2013C015），項目名稱：牛巴氏桿菌A型與B型莢膜亞單位疫苗的比較研究。

（作者單位：西南大學動物醫學院）