細(xì)菌脂磷壁酸在小鼠乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮形成中的作用

Ikram Ahmad(唐英俊)， 宣天梵， 陶夢(mèng)圓， 張思敏， 欒文杰， 亓發(fā)芝

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科，上海 200032

包膜攣縮是乳房假體植入術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，復(fù)發(fā)率高。過(guò)量的肌成纖維細(xì)胞激活和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積導(dǎo)致植入物周圍包膜增厚、變硬和收縮[1-4]。包膜攣縮是乳房假體植入術(shù)后再次手術(shù)的主要原因，迄今為止還沒(méi)有有效的預(yù)防方法。包膜攣縮的病因尚不清楚。研究表明，細(xì)菌感染，尤其表皮葡萄球菌感染，與包膜攣縮的發(fā)病具有相關(guān)性[5-10]。

表皮葡萄球菌是一種條件性致病菌，一般粘附于人體的皮膚和黏膜，在生理?xiàng)l件下，表皮葡萄球菌對(duì)人體無(wú)害，而免疫功能低下的患者感染風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加。由于其具有形成細(xì)菌生物膜的能力，表皮葡萄球菌可作為病原體在宿主體內(nèi)存活，生物膜保護(hù)細(xì)菌免受機(jī)體免疫系統(tǒng)和抗生素的清除[11-14]。本研究建立硅膠植入物周圍注射細(xì)菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)小鼠模型，采用H-E染色、Masson染色和酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色觀察植入物周圍組織結(jié)構(gòu)、纖維囊厚度和纖維化反應(yīng)程度；采用CD31染色計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量；采用定量PCR檢測(cè)炎癥因子mRNA水平；采用Ki-67/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)染色計(jì)數(shù)增殖/凋亡細(xì)胞，旨在明確細(xì)菌感染對(duì)乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮形成的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，成年，雄性，共12只。設(shè)植入物周圍注射細(xì)菌LTA組，以植入物周圍注射生理鹽水為對(duì)照組，隨機(jī)分組，每組6只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批(2016-123)。

1.2 硅膠植入物周圍注射細(xì)菌LTA模型 成年雄性C57BL/6小鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。無(wú)菌條件下在小鼠背部皮下置入0.2 cm×0.2 cm硅膠植入物，絲線縫合。在植入物周圍皮下注射細(xì)菌LTA(10 μg/mL，每個(gè)植入物周圍20 μL)。LTA第1次注射2 h后用于定量PCR檢測(cè)。LTA注射每次間隔48 h，注射6次后用于H-E染色、Masson染色和酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色。

1.3 Masson染色 石蠟切片脫蠟至蒸餾水。蘇木素染5～10 min。鹽酸酒精混合液分化。流動(dòng)水藍(lán)化，蒸餾水洗。麗春紅酸性品紅液中染5～8 min。蒸餾水洗。1%磷鉬酸中染1～3 min。不用水洗，直接入苯胺藍(lán)液或亮綠液 5 min。水速洗，置60℃溫箱中烘干，二甲苯透明，封片固定。

1.4 酶標(biāo)免疫組織化學(xué)染色 選取染色效果好與H-E染色同批次白片，烤片20 min。3%過(guò)氧化氫37℃，靜置10 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。抗原微波修復(fù)，室溫冷卻。封閉。室溫一抗孵育，45 min。二抗-酶標(biāo)聚物37℃放置30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.5 定量PCR 采用定量PCR分析移植物周圍LTA注射組和生理鹽水注射組炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)。按照TRIzol(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))操作步驟提取植入物周圍組織總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒(Takara，日本)，逆轉(zhuǎn)錄后，用TB GreenTMPremix ExTaqTM試劑盒(Takara，日本)行定量PCR檢測(cè)。設(shè)計(jì)白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)特異性引物，由Invitrogen公司合成，引物序列詳見(jiàn)表1。95℃孵育5 min預(yù)變性，95℃孵育10 s變性，60℃ 30 s退火/延伸，共40個(gè)循環(huán)。以各目的基因與Gapdh表達(dá)比值為其相對(duì)表達(dá)量。各樣品重復(fù)測(cè)量3次。

表1 炎癥因子目的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌LTA對(duì)植入物周圍纖維化反應(yīng)的作用 采用硅膠植入物周圍注射細(xì)菌LTA模型， Masson染色結(jié)果顯示：生理鹽水注射組的植入物周圍形成一層薄的藍(lán)色纖維囊；與生理鹽水注射組比較，細(xì)菌LTA注射組的植入物周圍纖維囊厚度增加了(1.3±0.08)倍(P<0.05)，呈藍(lán)色和紅色(變性纖維結(jié)締組織)，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：與生理鹽水組注射比較，細(xì)菌LTA注射組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)面積增加了(12.38±0.91)倍(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)纖維囊厚度的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度.*P<0.01與對(duì)照組相比

圖2 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)纖維化反應(yīng)的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍α-SMA面積.*P<0.01與生理鹽水組相比

2.2 細(xì)菌LTA對(duì)植入物周圍新生血管數(shù)量和炎癥反應(yīng)的作用 采用CD31染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究細(xì)菌LTA對(duì)植入物周圍新生血管數(shù)量的作用。結(jié)果(圖3)顯示，生理鹽水注射組植入物周圍新生血管數(shù)量為每視野(29±2.65)根，細(xì)菌LTA注射組植入物周圍新生血管數(shù)量為(64±4.85)根，注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍新生血管數(shù)量(P<0.05)。

圖3 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)新生血管數(shù)量的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍新生血管數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

采用定量PCR檢測(cè)植入物周圍炎癥因子，結(jié)果(圖4)顯示：與生理鹽水組比較，細(xì)菌LTA注射組增加植入物周圍IL-6 (P<0.05)和TNF-α mRNA水平(P<0.05)，不改變IFN-γ mRNA水平。

細(xì)菌LTA的受體是TLR2，采用定量PCR檢測(cè)植入物周圍TLR2 mRNA水平。與生理鹽水組比較，細(xì)菌LTA注射組提高植入物周圍TLR2 mRNA水平(P<0.05)。

圖4 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)炎癥反應(yīng)的作用

2.3 細(xì)菌LTA對(duì)植入物周圍細(xì)胞增殖、凋亡的作用 分別采用免疫組織化學(xué)方法，以Ki-67和Caspase-3染色標(biāo)記植入物周圍增殖細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。結(jié)果顯示：生理鹽水組注射組植入物周圍Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(48±3.67)個(gè)，細(xì)菌LTA注射組為(115±8.72)個(gè)，注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍增殖細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，見(jiàn)圖5。生理鹽水組注射組植入物周圍Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(38±2.65)個(gè)，細(xì)菌LTA注射組為(144±9.85)個(gè)，注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍凋亡細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖5 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)增殖細(xì)胞的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

圖6 植入物周圍注射細(xì)菌LTA對(duì)凋亡細(xì)胞的作用

A：生理鹽水組；B：LTA組；C：注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量.*P<0.01與生理鹽水組相比

3 討 論

細(xì)菌感染與乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮具有相關(guān)性。細(xì)菌感染在包膜攣縮發(fā)病過(guò)程中的作用有待證實(shí)。本研究表明，多次注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度和纖維化反應(yīng)，增加新生血管數(shù)量，增加IL-6、TNF-α、IFN-γ和TLR2 mRNA水平，增加增殖和凋亡細(xì)胞數(shù)量。

表皮葡萄球菌是條件致病菌，在生理?xiàng)l件下對(duì)人體無(wú)害；免疫功能低下的患者感染風(fēng)險(xiǎn)增加。由于其形成細(xì)菌生物膜的能力，表皮葡萄球菌可以作為病原體在宿主體內(nèi)存活。LTA是革蘭陽(yáng)性菌(如表皮葡萄球菌)細(xì)胞壁的組分，是核糖醇或甘油殘基由磷酸二鍵連接而成的多聚物。LTA的抗原性很強(qiáng)，是細(xì)菌的重要表面抗原。某些細(xì)菌的LTA能粘附在人類細(xì)胞表面，與致病性有關(guān)[15-17]。本研究結(jié)果顯示，多次局部注射細(xì)菌LTA能夠增加植入物周圍纖維囊厚度、纖維化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等，提示LTA是細(xì)菌感染誘發(fā)乳房假體植入術(shù)后包膜攣縮的充分條件，對(duì)提出預(yù)防包膜攣縮新策略具有重要意義。

已有文獻(xiàn)[18-24]報(bào)道，炎癥因子IL-6調(diào)控白細(xì)胞浸潤(rùn)參與宿主對(duì)細(xì)菌的急性防御反應(yīng)；IL-6-/-轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)法有效清除細(xì)菌感染；相反，在慢性疾病炎癥模型中，IL-6是慢性炎癥和纖維化的驅(qū)動(dòng)因子。本研究結(jié)果顯示，移植物周圍局部注射LTA增加IL-6 mRNA水平，提示細(xì)菌LTA誘發(fā)的包膜攣縮與炎癥因子IL-6具有相關(guān)性。

機(jī)體對(duì)病原微生物有固有性免疫和適應(yīng)性免疫2種應(yīng)答方式。病原微生物感染與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫力完全正常的宿主，固有性免疫足以將病原微生物清除；當(dāng)感染趨向于慢性，或者宿主曾被致敏，則適應(yīng)性免疫應(yīng)答迅速啟動(dòng)[25-27]。本研究結(jié)果顯示，多次局部注射細(xì)菌LTA增加植入物周圍纖維囊厚度，提示多次細(xì)菌感染或者細(xì)菌感染誘發(fā)的慢性炎癥過(guò)程與包膜攣縮的發(fā)生有關(guān)。

纖維囊是由成纖維細(xì)胞分裂、增殖、遷移，產(chǎn)生ECM形成的纖維結(jié)締組織。纖維化的過(guò)程包括：網(wǎng)狀纖維膠原化，膠原纖維變粗；成纖維細(xì)胞減少，炎細(xì)胞先后消失；新生血管退化，留下很少的小動(dòng)脈及小靜脈，質(zhì)地堅(jiān)韌，具有收縮性。本研究顯示，在纖維囊形成的過(guò)程中，LTA局部注射組，增殖細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)量都增加；新生血管數(shù)量增加，提示實(shí)驗(yàn)中LTA注射6次后取材，仍處于纖維囊形成、增厚的過(guò)程。

綜上所述，多次局部注射細(xì)菌LTA會(huì)增加植入物周圍纖維囊厚度，局部、反復(fù)或慢性細(xì)菌感染是乳房假體植入術(shù)后致包膜攣縮發(fā)病的充分條件，細(xì)菌LTA是促進(jìn)纖維化反應(yīng)的致病物質(zhì)。