自噬調控多功能蛋白p62/SQSTM1參與腫瘤及其微環境的研究進展

陳佳鋒， 傅修濤， 丁振斌

復旦大學附屬中山醫院肝臟外科，上海 200032

細胞中蛋白質的降解過程主要由泛素-蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統完成。自噬(autophagy)能夠調控各種生理和病理過程，甚至影響整個機體的代謝。自噬與腫瘤的關系錯綜復雜，其中自噬接頭蛋白p62/SQSTM1(以下簡稱“p62”)在腫瘤及其微環境中起到了重要作用。本文就自噬及多功能蛋白p62參與腫瘤及其微環境調控機制的研究進展作如下綜述。

1 自噬

自噬是真核細胞中進化上高度保守的，借助溶酶體將胞漿內代謝產物及受損細胞器降解成氨基酸、核苷等小分子并重新循環利用的生物學過程。根據自噬進入溶酶體的方式，可將自噬分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)[1]。通常意義的自噬即巨自噬，最主要的特征是形成杯狀雙層膜結構包裹未折疊蛋白質、受損細胞器，然后經過核化、延長，形成自噬小體，最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體以降解內膜及其包裹的底物[2]。

自噬根據底物的特異性和轉運機制的不同，可分為非選擇性自噬和選擇性自噬。前者非選擇性降解胞內大分子物質及細胞器并循環利用氨基酸等原料，這個過程受到細胞能量感受器AMPK和mTORC1的調控[3]。選擇性自噬，如線粒體自噬、過氧化物酶體自噬等，能在特定條件下清除受損細胞器，緩解內質網及線粒體氧化應激壓力，維持細胞的完整性和功能，抑制基因突變從而抑制腫瘤的發生。選擇性自噬需要自噬接頭蛋白或者其他靶向溶酶體的蛋白橋接特異性底物和自噬受體LC3(ATG8)。p62、NBR1、NDP52、Nix、Cb1、Stbd1、OPTN等均是含有人微管相關蛋白輕鏈識別序列(LC3-interacting region, LIR)結構域的自噬接頭蛋白，其中p62是最早被研究發現的自噬接頭蛋白[4]。

2 p62的分子結構及相關信號通路

2.1 p62的分子結構及細胞定位 自噬接頭蛋白p62已明確的作用域包括PB1結構域(Phox and Bem1p)、ZZ型鋅指結構域(Zinc finger)、TB結構域(TRAF6-binding domain)、LIR結構域、KIR結構域(Keap1-interacting region)和UBA結構域(ubiquitin-associated domain)[5]，見圖1。p62蛋白N端的PB1結構域與p62的低聚反應有關，該結構域同時與PKCζ、MEKK3、MEK5、ERK1和NBR1等序列相互作用，進而調控PKCζ-JNK-caspase3凋亡通路等；TB結構域和ZZ型鋅指結構域可以結合泛素連接酶(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)調控腫瘤壞死因子TNF-α及其下游信號通路；LIR結構域則結合自噬泡上微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)，是自噬過程的重要環節；KIR結構域則與Keap1-Nrf2信號通路有關；而C端的UBA結構域則參與蛋白酶體降解以及選擇性自噬的生理過程。正因為p62有多個功能的結構域，其在細胞凋亡、炎癥反應、細胞生存、信號轉導以及腫瘤進展等方面均起到了重要的調控作用[6]。

研究[7-8]發現，p62不僅廣泛存在于細胞質和細胞核，也分布于自噬體和溶酶體上。在應激環境下，該蛋白也可以定位于蛋白質聚集體、受損線粒體以及細胞內入侵的病原體上。

圖1 p62的分子結構及作用域

PB1：Phox and Bem1p結構域；ZZ：ZZ型鋅指結構域；NLS1：核輸出信號1；TB：TNF受體相關因子6綁定域；NLS2：核輸出信號2；NES：核定位信號；LIR：人微管相關蛋白1輕鏈3識別序列；KIR：Keap1作用域；UBA：泛素化相關域

2.2 p62相關信號通路 p62作為信號樞紐，參與激活mTORC1、NF-κB、PKCζ-JNK-caspase3和Keap1-Nrf2等多條重要信號通路。

(1)Keap1-Nrf2信號通路：研究[9-10]發現，ser349位點磷酸化的p62通過KIR結構域競爭性結合Keap1，釋放Nrf2進入細胞核內激活下游AREs和EpREs等反應元件表達，從而發揮抗氧化效應。而多種惡性腫瘤中廣泛存在Nrf2的持續激活，可通過調節谷氨酰胺分解、嘌呤核苷酸和谷胱甘肽合成以及磷酸戊糖途徑，促進腫瘤生長[11-12]。

(2)NF-κB信號通路：p62通過PB1結構域結合RIP，激活TNF-α介導的NF-κB信號通路，或者通過TB結構域結合TRAF6直接激活NF-κB通路[13]。該通路促進活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生，進而促進DNA損傷和基因突變，同時也可促進腫瘤細胞增殖和抑制p53介導的細胞凋亡。

(3)mTORC1信號通路：p62能夠與Rag、Raptor以及TRAF6蛋白相互作用增加mTORC1的活性，繼而激活S6K1、4EBP、ATF4等激酶，增強合成代謝反應，促進腫瘤細胞增殖[14-15]。同時，mTORC1持續激活上調癌基因c-Myc的活性，激活腫瘤相關纖維母細胞，促進轉化生長因子β(TGFβ)等的合成，從而促進腫瘤的形成[16]。

3 p62與自噬

研究[17-18]表明，p62蛋白可通過UBA和LIR結構域分別結合泛素化底物及自噬小體，將待降解底物轉運至自噬溶酶體系統。生理條件下，p62蛋白分子的UBA結構域形成穩定的二聚體，與泛素的親和力較低。但在泛素過表達、熱休克、蛋白酶體抑制劑等誘導下，該分子UBA結構域的Ser407位點被ULK1激酶磷酸化，激活成為單體。隨后，酪蛋白激酶-2或者TANK結合激酶-1磷酸化UBA結構域的Ser403位點，p62與泛素的結合力顯著增強。p62蛋白泛素化干擾UBA結構域的二聚化，從而恢復UBA結構域識別泛素化底物的效能，促進選擇性自噬的啟動[19]。在選擇性自噬中，p62不僅作為泛素化蛋白的接頭蛋白，也作為底物被自噬過程降解。因此，在生理條件下基礎水平的自噬可以維持p62處于一個較低的濃度水平。此外，NBR1和ALFY這2種與p62相互作用的蛋白同樣參與自噬過程，p62蛋白分子PB1結構域能夠結合NBR1，加速自噬對泛素化底物、蛋白聚集體、受損細胞器的降解，ALFY促進p62陽性聚合物的裝配進行自噬降解[20-21]。

4 p62與腫瘤及其微環境

4.1 p62與腫瘤 多功能蛋白p62涉及多種疾病的發生發展，包括佩吉特骨病、肌萎縮側索硬化及額顳葉變性等均與SQSTM1基因突變有關。研究[22-25]證明，肝細胞癌、胰腺癌、腎癌以及結直腸癌等多種腫瘤中均發現了p62聚集，并易在胞質內形成富含p62蛋白和泛素的馬洛里小體(Mallaory body，MB)和hyaline globule等包涵體，提示高水平的p62與腫瘤形成密切相關。Umemura等[15]研究發現，肝細胞癌的發生發展可能與p62激活Nrf2、mTORC1和c-Myc介導的通路有關，而且p62的聚集和肝癌術后的早期復發相關。Duran等[26]研究提示，p62敲除的小鼠中，RAS誘導的細胞轉化、腫瘤生成及NF-κB活性均受到抑制，同時細胞內ROS增強、凋亡增加，因此肺腺癌的發生率明顯下降。不僅如此，p62也是胰腺癌進展的重要驅動因子之一，在RAS誘導的胰腺導管腺癌小鼠中，NF-κB通路激活誘導p62的合成并作用于TRAF6，正反饋增強NF-κB信號通路，促進腫瘤進展。p62的聚集同時激活Nrf2信號通路，誘導癌基因MDM2表達，促進胰腺導管癌細胞的生長[22]。腫瘤干細胞是腫瘤治療后復發的重要原因之一。研究[27]發現，在乳腺癌腫瘤干細胞中，p62表達顯著增高，并且p62可以促進MYC的轉錄，從而影響乳腺癌腫瘤干細胞以誘導腫瘤復發和耐藥。

p62不僅在胞漿內發揮作用，也可調節細胞核內的轉錄過程，故p62也被視作轉錄調控蛋白之一，但細胞核內p62的功能尚不明確。研究[28]發現，細胞核內的p62水平與肺鱗狀細胞癌腫瘤分化程度相關，但與其他病理學或臨床指標沒有明顯相關性。在黑色素瘤中，FERMT2 mRNA是腫瘤轉移及預后不良指標，核內p62的PB1結構域可以和RNA結合蛋白IGF2BP1相互作用，繼而延長FERMT2半衰期，促進黑色素瘤的進展[29]。最新的一項食管癌研究[30]顯示，核內p62表達水平與化療的敏感性相關。新輔助化療和手術后，胞質內p62蛋白增加以及核內p62蛋白水平降低均提示預后不良。

4.2 p62和腫瘤微環境 腫瘤曾被認為是一種由于基因表達失調導致的細胞疾病，然而眾多研究[31-35]證實，腫瘤微環境(tumor microenviro-nment, TME)在腫瘤的發生、發展、轉移以及對腫瘤治療的抵抗方面都起到了重要作用。Valenci等[32]研究發現，與腫瘤細胞中的表達相反，p62在腫瘤基質(尤其是腫瘤相關成纖維細胞)中表達水平下調。深入研究[32-33]結果顯示，p62表達缺陷的纖維母細胞分泌更多IL-6，促進TGFβ的合成，誘導腫瘤相關成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，進而促進腫瘤的發展。同時成纖維細胞p62的缺陷導致c-Myc水平降低，下調還原型谷胱甘肽合成，氧化應激增強，進一步促進IL-6和TGFβ表達。前列腺癌中，p62缺陷的纖維母細胞抑制mTORC1/c-Myc信號通路激活，促使代謝重編程，IL-6和TGFβ分泌增加，細胞間質ROS增多，炎癥反應被激活，促進前列腺腫瘤細胞的增殖和侵襲。Linares等[34]研究表明，基質細胞p62表達缺陷，能夠誘導ATF4的聚集，啟動下游轉錄途徑，轉運天冬酰胺到腫瘤細胞中，維持腫瘤在營養缺乏的微環境下生存，同時激活mTORC1，進一步促進腫瘤發展。正常肝臟細胞中，p62蛋白能夠誘導VDR信號通路，抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的功能，抑制p62后，活化的HSC誘導肝臟炎癥反應及纖維化，支持腫瘤進展[35]。總之，p62能夠誘導腫瘤微環境代謝重編程，調節細胞因子分泌，從而發揮微環境調控腫瘤生長的功能。而抑制mTORC1的抗腫瘤治療的效果，會因基質中mTORC1失活產生的效應而降低，因此針對p62的靶向治療需要平衡其各方面的副作用。

4.3 自噬、p62與腫瘤及其微環境 p62介導的選擇性自噬及NF-κB等腫瘤刺激信號通路的激活可能是腫瘤形成的始動因素之一。在人EBV陽性B淋巴瘤細胞中，EBV感染產生的活性氧/活性氮(ROS/RNS)激活Keap1-Nrf2信號通路，誘導p62的過度累積以及介導的選擇性自噬，促進蛋白酶體對DNA修復蛋白CHK1和RAD51的降解，誘導腫瘤的形成[36]。多項研究[15,37-38]顯示，自噬缺陷不僅促進細胞內受損DNA的累積，染色體斷裂和不穩定，而且其引起的p62聚集能使NF-κB、mTORC1和Nrf2信號通路表達上調，誘發肝細胞癌形成。DEAD box蛋白5(DDX5)上調自噬水平后，可促進p62的降解，抑制腫瘤形成。而miR-17-5p可以上調DDX5，DDX5與p62結合后，干擾p62/TRAF6介導的mTOR信號通路的激活，進而延緩甚至阻止慢性肝病向腫瘤的進展[39]。細胞周期蛋白D1(cyclinD1)能夠促進細胞DNA合成及分裂。Wu等研究[40]證實，通過p62介導的對原癌基因miR-224和cyclinD1蛋白的選擇性自噬降解作用，能夠抑制肝細胞癌形成及進展。另外，研究[23]表明，SQSTM1基因高表達與腎透明細胞癌的發生相關，其表達產物p62蛋白促進了NF-κB、mTORC1和Nrf2信號通路。

在自噬起始復合物ULK1-ATG13-FIP20-ATG101形成受阻后，p62仍可以促進下游NF-κB通路維持腫瘤發展，因此p62和自噬協同維持腫瘤生長。p62的S351位點磷酸化可增強其在選擇性自噬過程中結合Keap1的能力，從而誘導Nrf2信號通路持續表達，改變腫瘤細胞代謝滿足其生長需要以及應對腫瘤微環境壓力，促進肝細胞肝癌的發展[9]。Wei等[41]通過一系列研究證實，在乳腺腫瘤中敲除FIP200抑制自噬后，再敲除p62可以進一步抑制腫瘤的生長。但也有研究[42]報道，Flightless-1(Flil)蛋白與p62相互作用，阻礙p62介導的選擇性自噬從而促進乳腺腫瘤進展。X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是多種腫瘤的促癌蛋白，在乳腺和結腸腫瘤中，XIAP能夠抑制p62的表達以及介導的選擇性自噬，進而導致腫瘤的發展和轉移[43]。研究[44]發現，在急性髓系白血病小鼠模型中，抑制p62可減少白血病細胞的增殖，阻礙白血病進展，而這歸功于p62的缺陷導致的線粒體自噬功能失調以及腫瘤細胞能量失衡。

腫瘤轉移涉及多步過程，包括腫瘤細胞獲得侵襲能力，脫離原發部位，侵入血管成為循環腫瘤細胞，最后移出血管定植在轉移部位。上皮來源的腫瘤細胞主要通過上皮向間質轉化(EMT)獲得侵襲、轉移能力。Jiang等[45]研究發現，前列腺癌中p62提升HDAC6水平，降低α-微管蛋白的乙酰化以及微管的穩定性，最終在選擇性自噬功能受損的情況下促進腫瘤EMT，增強癌細胞的增殖侵襲能力。與之類似，自噬抑制劑作用于RAS突變的腫瘤細胞后，p62集聚誘導NF-κB信號通路，繼而促進腫瘤EMT[46]。最近的一項研究[47]發現，通過藥物或者基因敲除等方法抑制自噬水平，能夠誘導糖酵解調節因子Pfkfb3的異常表達，促進乳腺腫瘤干細胞從休眠狀態轉變至增殖狀態，導致腫瘤復發。而激活自噬則可以使腫瘤干細胞處于休眠狀態，這其中的機制與p62的UBA結構域與Pfkfb3相互結合，促進后者的降解有關。另一項乳腺癌研究[48]證實，腫瘤中過表達的TRIM59抑制p62介導的對PDCD10的選擇性自噬降解，進而促進腫瘤的轉移能力。SNAI1是EMT的重要驅動因子之一，在HeLa和H1299細胞中，SNAI1和LC3及p62相互作用，促進前者被自噬過程降解，從而阻礙SNAI1進入細胞核內，抑制與腫瘤侵襲相關基因的轉錄[49]。

p62及自噬協同調控腫瘤微環境及免疫狀態。腫瘤基質中，p62可以介導RBPJ/CSL的自噬性降解，進而增加腫瘤相關成纖維細胞基因表達，維持周圍腫瘤細胞的生長[50]。Zhong等[51]研究證實，p62缺陷的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)線粒體自噬水平下降，導致受損線粒體以及NLRP3炎性小體的增加，刺激IL-1β和IL-18等細胞因子分泌，可以進一步促進腫瘤進展。在缺氧腫瘤微環境中，抑制自噬可以導致p62蛋白的累積并結合到活化的信號轉導與轉錄激活因子3(pSTAT3)，然后誘導泛素-蛋白酶體系統降解激活，從而提高免疫T細胞的腫瘤殺傷作用[52]。

p62及自噬的表達水平與腫瘤的化學治療反應密切相關。多項研究[53-54]顯示，耐鉑類藥物的卵巢上皮癌細胞內p62水平明顯增高，這與p62激活NF-κB通路有關，而通過自噬誘導劑降低p62水平可以明顯增加卵巢上皮癌對鉑類的敏感性。Battista等[55]研究發現，5-氟尿嘧啶、順鉑以及多西紫杉醇耐藥的人喉表皮癌細胞(TDR Hep-2)中p62-Nrf2通路水平明顯增高，以對抗化療藥物產生的氧化應激反應以及蛋白毒性。在KIR、LIR、UBA結構域變異的p62的Hep-2細胞中，腫瘤對化療藥物敏感性增加。因此，Leidal等[56]認為，在治療某些腫瘤的過程中，不僅要抑制自噬水平，需同時抑制p62的水平。

綜上所述，細胞自噬及p62對于腫瘤是一把雙刃劍，基礎水平的自噬可以維持染色體的穩定性，抑制腫瘤形成，但在腫瘤形成后可以維持腫瘤進展的營養代謝需求。抑制自噬后，高水平的p62可以通過Nrf2、NF-κB和mTORC1等信號通路促進血管生成以及腫瘤細胞生長，而在基質細胞中低水平的p62則通過促進IL-6和TGFβ等分泌，使腫瘤細胞代謝重新編程以應對營養缺乏的微環境。由于p62復雜的功能結構域參與多個重要信號通路網絡，同時影響自噬、細胞凋亡、免疫逃逸等多個生理病理過程，靶向p62藥物的效果在治療腫瘤過程中易受到腫瘤類型、分期、p62蛋白表達量以及其他藥物的影響。故調節自噬的藥物已在部分腫瘤中得到一定應用，但其對于治療腫瘤的有效性仍有待進一步考證。因此自噬與p62相互調節以及在腫瘤調控方面的作用需要更多深入的研究，最終為靶向自噬及p62的抗腫瘤藥物治療提供理論基礎。總之，當利用自噬系統進行腫瘤相關治療時，檢測腫瘤組織中p62的表達是一個較好的預后及治療輔助指標，同時需要考慮p62與相關通路的相互影響，以實現最佳的腫瘤聯合治療。