HPLC分析方法驗證中有關(guān)問題再探討

夏振華，劉文志，韓新榮，原潞潞

1 亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，運城 044602；2 廣州科銳特生物科技有限公司，廣州 510530；3 江蘇艾蘇萊生物科技有限公司，蘇州 215123

藥品測定的準(zhǔn)確性通常是通過控制分析方法的誤差來達(dá)到的，而分析方法是否準(zhǔn)確必須經(jīng)過分析方法的驗證來考察。因此分析方法驗證是保證藥物分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提和基礎(chǔ)。對于制藥企業(yè)而言，分析方法驗證是保證藥品質(zhì)量可控的重要環(huán)節(jié)，同時也是企業(yè)技術(shù)水平的直接體現(xiàn)，無論企業(yè)的新藥報批、還是國外注冊和GMP檢查，都有關(guān)于分析方法驗證的明確要求。

《中國藥典》2020版征求意見稿[1]、美國藥典[2]及ICH[3]分析方法驗證都制定有相應(yīng)的指導(dǎo)原則，但均很寬泛，鮮有具體操作或說明規(guī)定的理由，以至于日常驗證中對技術(shù)要求和法規(guī)要求產(chǎn)生理解上的偏差。如僅僅通過信噪比即確定方法的定量限，把線性的范圍等同于定量的范圍，沒有關(guān)注樣品的處理過程的驗證；又如振搖溶出參數(shù)、樣品溶液濃度、濾膜的相容性等驗證內(nèi)容以及系統(tǒng)適用性參數(shù)的制定不是根據(jù)驗證的耐用性結(jié)果來制定的，有關(guān)物質(zhì)的精密度測定的樣品使用不含有待測有關(guān)物質(zhì)等。總之，需要理解驗證的真正目的和質(zhì)量控制的基本原理，才能把握正確操作，使分析方法驗證能真正起到保證藥品質(zhì)量控制的作用。

1 關(guān)于分析方法生命周期問題

近年來，ICH和《美國藥典》納入了[4]生命周期管理的理念，《美國藥典》甚至直接將“分析方法的生命周期”作為一個新的通用章節(jié)（1220）予以收錄。

分析方法的生命周期分三個階段：①設(shè)計和開發(fā)階段；②驗證階段；③持續(xù)監(jiān)測階段。分析方法的驗證不是孤立的一項工作，它和分析方法的開發(fā)，甚至分析方法的設(shè)計分不開的，分析方法開發(fā)和驗證是一個有機(jī)整體，即使分析方法驗證完成后，仍需要在分析方法的生命周期中用于常規(guī)的放行或穩(wěn)定性測試中持續(xù)監(jiān)測分析方法的性能，以及測定結(jié)果是否滿足質(zhì)量控制要求，這是分析方法驗證的最后一個階段，直至分析方法的終止。分析方法驗證和產(chǎn)品持續(xù)穩(wěn)定性考察原理相同，重要性也是相當(dāng)?shù)模灰虼私ㄗh企業(yè)年度報告中增加一項分析方法的性能總結(jié)等內(nèi)容，如分析一年共有多少OOS（超標(biāo)）和OOT（超趨勢）是由于分析方法本身的缺陷而引起的，并制訂糾正預(yù)防措施，以便對所采用的分析方法進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)。目前國內(nèi)幾乎沒有企業(yè)進(jìn)行這項工作，法規(guī)檢查也忽略了這一重要內(nèi)容。

2 關(guān)于分析方法的專屬性

2.1 峰純度問題

專屬性是建立分析方法首先要考慮的問題，否則往往會導(dǎo)致測定的系統(tǒng)誤差，而且在日常測定中很難發(fā)現(xiàn)，尤其當(dāng)多個組分出峰完全重疊時，需要通過驗證專屬性的峰純度加以考察。對于老產(chǎn)品的專屬性的驗證，使用過期樣品進(jìn)行峰純度測定可能比強(qiáng)制降解樣品更為科學(xué)，此外需要注意實際驗證中經(jīng)常出現(xiàn)峰純度“假合格”和“假不合格”現(xiàn)象。“假合格”主要由于檢測技術(shù)的限制使峰重疊等情況未能鑒別；但“假不合格”情況更多，主要是樣品響應(yīng)過高或過低、波長選擇接近流動相中的有機(jī)相截止波長，緩沖鹽的濃度過高或流動相附加劑的純度等因素影響所致。

2.2 物料平衡問題

強(qiáng)制降解的物料平衡是廣大分析工作者最為頭痛的問題，分析方法驗證的指導(dǎo)原則中沒有關(guān)于降解條件的特別規(guī)定，因此做法各不相同。由于物料平衡主要是考察分析方法能否將所有雜質(zhì)有效檢出，所以含量測定沒有必要進(jìn)行物料平衡的考察，物料平衡的接受范圍問題，至今沒有統(tǒng)一的規(guī)定，其實以后也很難統(tǒng)一，需要具體情況具體分析。根據(jù)樣品中各組分性質(zhì)、降解率大小、強(qiáng)制降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)限度要求等因素作綜合考慮，建議平衡率設(shè)置為95.0%～105.0%較為合適。有些企業(yè)將其制定為98.0%～102.0%，接受標(biāo)準(zhǔn)過于嚴(yán)格，只考慮HPLC方法本身誤差，沒有考慮未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、介質(zhì)pH等因素的影響；也有些企業(yè)對于制劑考慮到輔料的影響，將平衡率制定為90.0%～110.0%，又過于寬松，失去物料平衡考察的意義。

2.3 分離度的計算問題

分離度是HPLC法測定中重要的系統(tǒng)適用性參數(shù)，也是專屬性的重要考察參數(shù)之一，對于拖尾峰和峰形不好的峰，現(xiàn)代的色譜積分技術(shù)基本均能夠很好解決分離度的計算問題，對于分離不好，尤其是色譜峰峰響應(yīng)差別大的兩組分不完全分離的情形，積分技術(shù)很難科學(xué)解決，改善分離成為唯一手段。《中國藥典》2020版征求意見稿[5]和《美國藥典》[6]均有二種方法即峰底寬法和半峰寬法，其實兩者本質(zhì)均一樣；《歐洲藥典》[7]有兩種計算方法，即半峰寬法和峰谷比法（p/v法）。但對于兩個組分響應(yīng)相差很大或一個組分由于過載產(chǎn)生嚴(yán)重變形時，這些傳統(tǒng)的分離度公式均不適用，會導(dǎo)致結(jié)果偏低或偏高，不能有效地反映真正的分離情況。此時如采用峰谷比法[7]或使用柱效、選擇性和容量因子的公式進(jìn)行計算[8]更為科學(xué)，可惜各國藥典均沒有收載這一科學(xué)的分離度計算方式。

2.4 空白輔料峰的問題

盡管待測溶液已過濾了空白輔料變得澄清，但測定溶液中空白輔料成分依然可達(dá)主成分濃度的幾倍甚至幾百倍以上，在進(jìn)樣后使流動相體系產(chǎn)生瞬間的波動，導(dǎo)致在死時間附近出現(xiàn)輔料峰，該峰往往是輔料的折、散射產(chǎn)生的峰，而不其吸收產(chǎn)生的，所以其響應(yīng)并不遵循朗伯比爾定律，有時同樣配方量的空白輔料和空白片產(chǎn)生的峰面積相差很大，不同品牌的輔料甚至同一品牌不同貯存條件、不同時間產(chǎn)生的峰也不一致，鑒于輔料峰的復(fù)雜性以及工藝的保密性，實際工作中如出現(xiàn)輔料產(chǎn)生的峰，一定要進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查，弄清是什么輔料、什么原因產(chǎn)生的，而不能簡單地在檢驗規(guī)程中要求進(jìn)樣空白輔料溶液，這樣既不科學(xué)也不現(xiàn)實。

3 關(guān)于分析方法驗證的精密度

實際測定時雖然精密度好，但由于方法或測定儀器等系統(tǒng)誤差因素，往往準(zhǔn)確度未必好，但反之，精密度不好、準(zhǔn)確度很難得到保證，因為測定的準(zhǔn)確度是建立在良好的精密度基礎(chǔ)上的，所以日常測定是通過測定平行樣品，考察測定誤差來達(dá)到控制準(zhǔn)確度的目的。在日常驗證過程中，精密度測定時常見以下一些問題：

3.1 有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑的精密度

在有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑的精密度測定時，當(dāng)使用樣品測定結(jié)果為未檢出，由于分析方法是適用于符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的所有樣品，所以應(yīng)該在樣品中加入適量的（如限度的50%～100%）待測雜質(zhì)對照品，測定其含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察精密度是否符合測定要求，如不是同一貯備液進(jìn)行稀釋，由于貯備液取樣量不同，需要通過計算回收率的RSD%來考察精密度是否符合測定要求。

對于有關(guān)物質(zhì)的測定方法的精密度驗證，除考察其含量的精密度外，還要考察忽略限以上雜質(zhì)個數(shù)是否一致，這常被忽視。此外，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中如規(guī)定最大未知單一雜質(zhì)時，需標(biāo)明最大單一雜質(zhì)的保留時間或相對保留時間，防止不同樣品測定時最大單一雜質(zhì)的峰發(fā)生改變而失去統(tǒng)計意義。

3.2 含量均勻度

對于使用含量均勻度測定結(jié)果作為含量放行數(shù)據(jù)的分析方法，其精密度的驗證就比較復(fù)雜，由于含量均勻度一般取10片/粒藥物來測定結(jié)果的平均值，作為含量放行數(shù)據(jù)，同時計算A+2.2S值作為均勻度考察的指標(biāo)，在該情況下，含量的精密度驗證應(yīng)該按照含量均勻度的10份而不是6份測定結(jié)果進(jìn)行精密度考察，即每人測定10份，2人共20份，計算A+2.2S值作為考察指標(biāo)，并與同批通過研磨或混合手段取得均勻樣本測定的含量進(jìn)行比較。

3.3 精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)問題

《中國藥典》2020版征求意見稿[1]對精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)有詳細(xì)規(guī)定，但這些指標(biāo)值只考慮濃度對誤差的影響，沒有考慮方法操作（如預(yù)處理過程）、儀器本身等影響因素。藥典也規(guī)定了適當(dāng)放寬情況，所以可以根據(jù)實際情況制定接受標(biāo)準(zhǔn)，如對于含量RSD%接受標(biāo)準(zhǔn)一般為≤2.0%，但這個不是絕對的，對于原料藥或范圍要求很窄的制劑（制劑含量范圍主要是考慮生產(chǎn)和工藝的波動范圍，適當(dāng)考慮分析測定的誤差范圍），應(yīng)該制定更小的RSD%接受標(biāo)準(zhǔn)，如≤1.0%，以保證方法能夠滿足質(zhì)量控制的要求。對于雜質(zhì)測定方法驗證的精密度接受標(biāo)準(zhǔn)列于表1供驗證時參照使用，此表也適用于殘留溶劑等微量成分的定量測定。

表1 雜質(zhì)測定方法精密度接受標(biāo)準(zhǔn)推薦表

4 關(guān)于分析方法驗證的檢測限和定量限

任何測定方法包括測定儀器都有其靈敏度的限制，對于微量組分的測定，考察檢測限和定量限非常必要，對于低于檢測限的測定結(jié)果應(yīng)為未檢出（Not detected或ND表示），對于＞檢測限、但低于定量限的測定結(jié)果，建議結(jié)果表達(dá)為低于定量限（below quantitation limit，BQL），只有高于定量限才可能準(zhǔn)確報告檢測數(shù)據(jù)，對于＜忽略限的測定結(jié)果通常使用低于忽略限（below disregard limit，BDL），但需要注明忽略限的具體規(guī)定如0.03%，此外忽略限不能＜定量限。關(guān)于檢測限和定量限需要注意以下幾個問題：

4.1 信噪比法的缺陷

ICH[3]信噪比法測定檢測限和定量限，是將儀器的靈敏度測定方法用于分析方法，不太科學(xué)；因為待測組分和噪音的響應(yīng)受儀器、柱效、試劑等影響，信噪比法測定的檢測限和定量限不具有普遍意義上的代表性，只是一個偶然值，根據(jù)定量限原理，信噪比不＜10，必須所有測定結(jié)果（如通常6次）均不＜10，不能取平均值不＜10，也沒有必要制訂一個范圍如8～12。此外，對所有定量限下測定峰面積的偏差需要制定一個接受標(biāo)準(zhǔn)，如RSD%≤10%，以彌補精密度測定沒有考察定量限濃度下的精密度，同時定量限濃度需要符合線性和準(zhǔn)確度要求，只有這幾個條件全部具備才能確定為定量限，為此，通常先根據(jù)質(zhì)量控制要求確定一個忽略限，然后直接進(jìn)行信噪比測定，關(guān)注信噪比是否不＜10，不必考慮信噪比的具體數(shù)值是多少。由于信噪比法測定定量限值影響因素多，波動大，所以定量限除考察信噪比外，還應(yīng)制訂定量限不＞雜質(zhì)限度的50%或更低的要求，以彌補這一不足，如果定量限接近限度值，建議使用限度法進(jìn)行雜質(zhì)控制，而不能使用定量法進(jìn)行限度的質(zhì)量控制。基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，雖然和信噪比法原理相同，但比信噪比法結(jié)果重現(xiàn)性更好些，似乎有代替信噪比法的趨勢。

4.2 關(guān)于噪音的測定

噪音的測定非常講究，除應(yīng)該選擇平滑的地方外，還建議應(yīng)該在離目標(biāo)峰附近前后兩段進(jìn)行，取其最高者；因為只有目標(biāo)峰附近的噪音才影響目標(biāo)物的測定，遠(yuǎn)離目標(biāo)峰噪音再大也不影響測定。測定噪音的時間30秒，如果成分多，以梯度洗脫方法15秒即可，因為15秒兩組分已能很好地分離，目前所有組分用某一段相同的基線測噪音并不太科學(xué)（除非基線很一致），收集60秒以上更沒必要，是自找麻煩的做法。

4.3 忽略限制定問題

忽略限和報告限數(shù)據(jù)值相同，但含義不同，前者為方法中的一部分，后者為制訂雜質(zhì)質(zhì)量控制策略提供依據(jù)。制定忽略限需要根據(jù)方法和測定質(zhì)量控制的要求，以及法規(guī)要求等因素綜合考慮，由于儀器的噪音等因素，使用HPLC法測定雜質(zhì)時，雖然《中國藥典》沒有提及忽略限，但在實際工作中制定了忽略限，將＜忽略限的峰不予計算，減少不少麻煩，ICH對報告限有具體規(guī)定，但只是基本要求，建議日常工作中制定更為嚴(yán)格要求容易獲得專家的認(rèn)可。通常將忽略限規(guī)定為0.03%，但不能一概而論，具體制定策略需要根據(jù)方法本身的噪音大小、雜質(zhì)限度大小等因素來制定。原則上忽略限為雜質(zhì)限度的1/5以下，如1/5計算值＞0.03%，取0.03%，如＜0.03%取1/5計算值，忽略限必須不能＜定量限，對于穩(wěn)定性考察的測定由于需要進(jìn)行趨勢分析，建議直接將定量限作為報告限更有適用性。

5 關(guān)于分析方法驗證的線性和范圍

線性關(guān)系考察是定量分析的基礎(chǔ)和必要條件，定量是基于呈一元一次方程的線性關(guān)系進(jìn)行的，對于不呈線性的方法，可以通過轉(zhuǎn)換，如HPLC-ELSD檢測或使用二次擬合曲線法，如HPLC-CAD檢測，但線性不是定量的充分條件，呈線性未必能夠準(zhǔn)確定量；這特別多見于低濃度受輔料干擾（線性一般只使用對照品進(jìn)行）以及有背景吸收和扭曲效應(yīng)等影響的情況，所以此時還需要考察方程的準(zhǔn)確度和精密度，確定測定范圍。此外，除了考察相關(guān)系數(shù)以確定是否呈線性外，還必須考察回歸方程的截距問題，通常使用兩種方法：一種為Y軸截距絕對值與標(biāo)準(zhǔn)（100%）之比法；另一種為剩余標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)（100%）之比法。兩種方法均能反映截距的大小，對于含量應(yīng)該不＞2%，對于有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑應(yīng)該不＞25%（建議不＞15%更科學(xué)），如果截距不符合要求，不能說明方法不能定量，只是不能采用常用的一個對照濃度進(jìn)行測定，需要每次測定時采用多個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行。

《中國藥典》2020版征求意見稿[1]參照ICH要求報告殘差平方和，這一指標(biāo)是考察線性的各點偏離程度，是考察線性斜率、截距、線性的綜合的標(biāo)準(zhǔn)，無法制定統(tǒng)一可建議的接受標(biāo)準(zhǔn)，法規(guī)上通常是要求報告殘差平方和的數(shù)值，用于評定方法的優(yōu)劣。

6 關(guān)于分析方法驗證的準(zhǔn)確度

雖然檢測永遠(yuǎn)不能測定到待測成分的真實含量，但測定結(jié)果盡量接近真值是分析工作者的最高目標(biāo)。雖然加樣回收率對于某些樣品由于崩解溶出等因素的影響不能完全反映準(zhǔn)確度，但其仍然是驗證方法準(zhǔn)確度最好的方法，了解以下幾個問題對于準(zhǔn)確度的測定會有裨益。

6.1 《中國藥典》2020版征求意見稿[1]關(guān)于回收率的接受標(biāo)準(zhǔn)為非對稱范圍，如98%～101%，因為不可能有化合物含量超過100%，超過100%部分完全是分析誤差，所以原料藥的標(biāo)準(zhǔn)范圍呈非對稱，如98.5%～101.0%，而加樣回收率不同，真實含量為100%的上下波動，呈對稱的正態(tài)誤差分布，這一規(guī)定誤導(dǎo)分析方法允許存在系統(tǒng)誤差，即高于100%的誤差小于低于100%的誤差，藥典表2中的回收率范圍小數(shù)點位數(shù)不科學(xué)，98%～101%應(yīng)為98.0%～101.0%，此外還有其他諸多問題，建議實際工作中不予采納，對于雜質(zhì)測定方法驗證的回收率范圍及誤差接受標(biāo)準(zhǔn)，列于表2供驗證時參照使用，此表適用于殘留溶劑等微量成分的定量測定。

表2 雜質(zhì)回收率范圍及誤差表

6.2 對于有關(guān)物質(zhì)（包括溶劑殘留）的定量測定，由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不是范圍，僅是限度，所以應(yīng)該分兩部分進(jìn)行，即在LOQ的濃度下和限度附近（限度的50%、100%和150%），其中限度濃度是決定產(chǎn)品合格不合格的關(guān)鍵濃度，是風(fēng)險最大的區(qū)域，所以需要在該濃度的附近進(jìn)行準(zhǔn)確度的測定，不做50%的限度濃度是不科學(xué)，回收率范圍一般規(guī)定為80.0%～120.0%，9次測定結(jié)果的RSD應(yīng)≤10.0%，如果限度濃度高，可以嚴(yán)格到90.0%～110.0%，甚至95.0%～105.0%，而LOQ濃度比較低，加上遠(yuǎn)離限度值，風(fēng)險較小，回收率范圍可以適當(dāng)放大到70%～130%，根據(jù)驗證回收率來制訂內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不失為一種科學(xué)的方法，如回收率為85.0%，考慮方法的準(zhǔn)確度，限度可以從0.2%修訂為0.17%。

6.3 對于有關(guān)物質(zhì)測定，由于雜質(zhì)對照品較難獲得，常常使用與主成分相比進(jìn)行測定，由于雜質(zhì)和主成分的結(jié)構(gòu)不同，響應(yīng)可能不同，需要進(jìn)行校正才能測定真實含量，否則為表觀含量。《中國藥典》2020版征求意見稿[5]和《歐洲藥典》[7]使用的為校正因子，而《美國藥典》[6]使用的是響應(yīng)因子，兩者互為倒數(shù)關(guān)系，對于質(zhì)量型檢測器由于響應(yīng)與待測組分的質(zhì)量關(guān)系，所以通常不需要測定校正因子。

校正因子最好為不同儀器和人員，至少測定兩次，允許誤差一般為10%，這是基于雜質(zhì)回收率要求在90.0%～110.0%，這也就是國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心[9]規(guī)定0.9～1.1可不需要校正的原因，《英國藥典》要求將0.8～1.2可不進(jìn)行校正，此規(guī)定范圍過于寬松，建議不予采用。此外，如藥典方法進(jìn)行驗證或確認(rèn)時，和藥典規(guī)定值比較誤差也應(yīng)在10%內(nèi)，由于影響校正因子準(zhǔn)確的因素很多，如對照品含量誤差（如吸水）、保留時間差別大、峰型差別大（如拖尾嚴(yán)重）、DAD和紫外檢測器的差別、鹽類藥物對照品沒有折算成活性部分等，鑒于藥典校正因子的測定次數(shù)多，日常測定盡量使用藥典的校正因子進(jìn)行。

即使校正因子在0.9～1.0之間，建議按照實際測定校正因子的數(shù)值進(jìn)行，可避免多次測定結(jié)果值在邊緣上下的時候處理數(shù)據(jù)的麻煩，如校正因子發(fā)生改變，必須對以前測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，特別是校正因子變大的情形。鑒于校正因子重要性，不管結(jié)果是否＜1.0，其結(jié)果建議均應(yīng)保留小數(shù)點二位。

雜質(zhì)的校正因子的測定有多種方法，但使用雜質(zhì)線性的斜率和主成分的線性斜率比最為常見，雜質(zhì)的線性最大濃度為限度的150%（或120%濃度），最低濃度為定量限（或忽略限濃度），但主成分的線性濃度要考慮不同限度要求的雜質(zhì)以及低濃度的因素，最大濃度的確定比較復(fù)雜，建議使用最大的限度值的雜質(zhì)的150%，或測定的對照低濃度的150%（兩者取最大者）進(jìn)行，以滿足所有雜質(zhì)測定的要求。

6.4 雖然討論的主要針對HPLC法，對于頂空氣相色譜準(zhǔn)確度的驗證，需要關(guān)注的是由于其測定原理是氣液平衡，測定的是相對回收率，所以影響組分的氣液平衡的因素在方法開發(fā)和方法驗證中均要考慮，特別是對照溶液和樣品溶液的溶質(zhì)有很大差別，樣品溶液中含有高濃度的樣品，存在樣品的基質(zhì)效應(yīng)，該效應(yīng)有時是正效應(yīng)，有時是負(fù)效應(yīng)，正效應(yīng)導(dǎo)致回收率偏高，負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致回收率偏低，具體與待測組分的結(jié)構(gòu)、沸點、性質(zhì)、稀釋劑的種類有關(guān)，基質(zhì)效應(yīng)是頂空最大難題，在滿足測定要求情況下減少樣品量可以減少基質(zhì)效應(yīng)，但不能徹底消除，徹底消除基質(zhì)效應(yīng)的最好方法是采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測定。

6.5 制劑和原料藥的主成分含量的準(zhǔn)確度測定濃度選擇范圍均在80%、100%、120%三個濃度下進(jìn)行，但其目的并不相同，制劑的標(biāo)示量通常在90.0%～110.0%，考慮到風(fēng)險問題以及方法的適用性，所以在80.0%～120.0%濃度范圍進(jìn)行，而原料藥是基于藥典精密稱量約的含義為±10%，即供試品濃度的90.0%～110.0%，同樣考慮到風(fēng)險問題以及方法適用性更廣的原因，適當(dāng)放寬為80.0%～120.0%濃度范圍，對于中藥，由于其主成分復(fù)雜，通常放寬到50%～150%的濃度范圍。

《中國藥典》2020版征求意見稿[1]規(guī)定如不能得到輔料全部成分，使用樣品加入待測對照成分進(jìn)行回收率考察，這樣操作會導(dǎo)致實際待測成分均在測定濃度之上，沒有包含低于測定濃度的準(zhǔn)確度情況，而低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定測定邊緣數(shù)據(jù)得不到驗證，存在極大風(fēng)險。對于企業(yè)而言，在知曉處方和工藝情況下，最好進(jìn)行模擬處方法進(jìn)行回收率試驗。

7 關(guān)于分析方法驗證的耐用性

分析用儀器雖然經(jīng)過校正，但允許存在一定的誤差，如紫外檢測器波長允許±1 nm，柱溫允許±1 ℃～2 ℃等，分析方法沒有規(guī)定一定要在驗證方法儀器上測定，是所有經(jīng)過校正合格的儀器上都能適用。此外，還有一個目的，是通過耐用性測定，在耐用性變動參數(shù)范圍內(nèi)改變均不算改變方法，比如流速，雖然儀器流速誤差小，但仍然進(jìn)行有±10%～20%的變動耐用性考察，主要是實際測定時為了保證符合系統(tǒng)適用性要求對某些參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。耐用性還要發(fā)現(xiàn)方法的風(fēng)險點，為以后日常測定出現(xiàn)異常提供一些參考的信息。

7.1 耐用性除測定系統(tǒng)適用性參數(shù)外，還需測定目標(biāo)物的含量并與正常測定條件作比較，在規(guī)定范圍內(nèi)，對于雜質(zhì)測定方法還需要統(tǒng)計雜質(zhì)個數(shù)和最大未知雜質(zhì)的保留時間或相對保留時間，以考察不同條件下方法的檢測能力是否耐用。

7.2 關(guān)于耐用性波長的考察，《中國藥典》2020版征求意見稿[1]沒有提及，主要是否進(jìn)行波長微小變化的考察取決于測定方法，如HPLC法采用紫外檢測器測定主成分時，往往利用同一結(jié)構(gòu)的對照品進(jìn)行比較，由于對照品和測定的主成分結(jié)構(gòu)相同，其紫外吸收相同，所以耐用性就沒有必要進(jìn)行不同波長的耐用性考察，但如與主成分比較測定雜質(zhì)，由于雜質(zhì)和主成分結(jié)構(gòu)不同，不同波長的校正因子不同，不同儀器波長存在一定的偏差如±2 nm，所以即使《中國藥典》2020版征求意見稿[5]規(guī)定分析方法的波長不能改變，但耐用性驗證需要考察不同波長情況下的測定結(jié)果，如波長參數(shù)耐用性不好，建議改為外標(biāo)法，也可重新選擇測定波長，使雜質(zhì)和主成份在該波長附近紫外吸收曲線趨勢盡量一致。

7.3 耐用性參數(shù)的變化在考慮儀器和計量誤差范圍外適當(dāng)放寬即可，如果變化值放得過寬，會引起耐用性失敗，如柱溫，通常柱溫箱的溫度精度為±2 ℃，耐用性只需做到±3 ℃即可，同樣，波長變化范圍±2 nm（或±3 nm）。耐用性結(jié)果如發(fā)現(xiàn)分析條件對測定結(jié)果影響很大，必須在方法中予以說明，如緩沖液pH的變化范圍±0.2，出現(xiàn)耐用性不好，可以嚴(yán)格到±0.1，但必須在分析方法中注明（不注明可視為±0.2）。

7.4 對照品溶液和樣品溶液穩(wěn)定性考察可以在耐用性中進(jìn)行，因為對照品溶液需要作為控制對照在檢測最后測定，以考察系統(tǒng)是否漂移。而樣品溶液需要在穩(wěn)定性情況下才具有代表性，測定時儀器不關(guān)閉才有驗證意義，這和貯備液的穩(wěn)定性考察不同，后者不是方法本身一部分，是為了節(jié)省對照品的用量而采取的管理上的措施，不需要在方法驗證中同時進(jìn)行，切不可混淆。

8 關(guān)于分析方法驗證的系統(tǒng)適用性

系統(tǒng)適用性是保證測定結(jié)果準(zhǔn)確的前提，分析方法驗證不管進(jìn)行什么項目的驗證，均應(yīng)作系統(tǒng)適用性的測定，以考察測定是否有效？如果測定方法中對照溶液參與測定計算還應(yīng)進(jìn)行檢查對照的測定，以考察工作對照的容量操作是否有問題？如測定時間較長，還應(yīng)該進(jìn)行控制對照的測定，以考察整個測定過程中系統(tǒng)是否漂移？如果方法比較穩(wěn)定，不必在測定過程中定期測定控制對照。此外，在驗證總結(jié)中需將所有的系統(tǒng)適用性的數(shù)據(jù)予以列出，以利于評審專家的審評。

9 方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移是一個比較經(jīng)濟(jì)的驗證分析方法，也是準(zhǔn)確性的方式，《中國藥典》2020版征求意見稿[10，11]專門增加了分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移兩個指導(dǎo)原則，從法規(guī)上給予分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移的合法地位，是新版藥典的亮點之一。雖然指導(dǎo)原則比較原則，但其意義很大，如制劑企業(yè)購買的原料藥、輔料，其驗證工作量巨大，如采用分析方法轉(zhuǎn)移的方式可大大減輕企業(yè)負(fù)擔(dān)，方法轉(zhuǎn)移可以同一公司不同部門，也可以不同公司之間，但產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝或處方必須完全一致，否則只能驗證或確認(rèn)。轉(zhuǎn)移方式有4種[11]，即比對試驗、共同驗證、再驗證、轉(zhuǎn)移豁免，其中比對測試最為常用。

方法確認(rèn)系藥典方法，由于方法內(nèi)容、樣品情況不同，方法確認(rèn)的項目指導(dǎo)原則[10]未作出具體規(guī)定，需要根據(jù)實際情況經(jīng)過科學(xué)評估進(jìn)行選擇，由于原料藥沒有輔料的干擾和不存在崩解等因素，確認(rèn)對于原料藥較為適用，一般進(jìn)行專屬性、精密度和線性范圍三個項目，分別考察干擾情況、測定誤差和定量基礎(chǔ)是否影響測定方法的準(zhǔn)確度，如雜質(zhì)的微量測定方法，還需要作定量限和檢測限的測定，以考察方法靈敏度，對于制劑測定方法，由于輔料及工藝對測定方法準(zhǔn)確度影響的復(fù)雜性，不建議進(jìn)行確認(rèn)，即使確認(rèn)，除非有足夠的科學(xué)評估，否則確認(rèn)項目為除了耐用性外的其他所有驗證項目。

10 其 他

10.1 對照品標(biāo)化所采用分析方法應(yīng)該經(jīng)過驗證，但驗證需要標(biāo)化后的對照品才能進(jìn)行，這就存在“先有雞還是先有蛋”的矛盾，如何解決這一問題，建議將對照品的標(biāo)化和分析方法驗證一起進(jìn)行，兩者同時進(jìn)行以解決這一矛盾。

10.2 檢測限和定量限、線性和范圍、定量限濃度下的準(zhǔn)確度三個項目一般直接使用對照品進(jìn)行，也不需要加入樣品，而其他項目則需要具體項目具體分析，如原料藥不含輔料，在準(zhǔn)確度的測定時，使用50%的測定濃度的樣品溶液，分別加入30%、50%、70%的測定濃度的對照品來測定回收率。

10.3 通常分析方法與工藝及設(shè)備驗證不同，不需要進(jìn)行周期性再驗證，即使儀器搬遷也不需要進(jìn)行方法本身的再驗證（儀器再確認(rèn)是必須的），這是由于方法驗證的目的和內(nèi)容決定的，但如果生產(chǎn)工藝或處方的改變，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度或分析方法發(fā)生變化即使稀釋劑的改變，都應(yīng)該進(jìn)行方法再驗證，方法再驗證不代表全驗證，驗證哪些項目依據(jù)具體情況進(jìn)行評估后確定，可能評估結(jié)果是再驗證，只需進(jìn)行專屬性驗證，甚至可能不需要進(jìn)行再驗證。