五味子丙素抑制脂多糖誘導心肌細胞的炎癥反應與細胞焦亡的作用及機制研究

劉力亨

南京醫科大學附屬兒童醫院 藥學部，南京 210008

膿毒癥引起的心肌病是膿毒癥和膿毒性休克的常見并發癥之一，其最早的臨床表現是心功能不全：左心室擴張和射血分數下降，并伴有細胞炎癥、凋亡與焦亡[1-3]。細胞焦亡[4]（pyroptosis）又稱細胞炎性壞死，是近年來新發現并證實的一種程序性死亡方式。它依賴于半胱天冬酶（caspase-1）活化并通過切割消皮素（gasdermin D，GSDMD）得到其N端產物（GSDMD-NT），在細胞膜上成孔，使炎癥因子如白介素（IL-1β）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等分泌至細胞外，形成炎癥。

五味子丙素（schisandrin C，SchC）是傳統中草藥五味子中的主要成分之一，它具有多種藥理活性，包括抗炎、保肝、抗癌和免疫激活，并且可影響呼吸、心血管和中樞神經系統[5，6]。研究報道，五味子丙素對阿昔洛韋誘導的（NOD-，LRR-and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥小體激活、IL-1β 分泌和細胞焦亡具有緩解作用[8]，但其對于脂多糖（LPS）引起的細胞焦亡的影響尚不明確。現利用小鼠心肌細胞HL-1研究五味子丙素對LPS引起的細胞焦亡和損傷的影響。

1 材 料

五味子丙素（SchC）購自上海陶素生化科技有限公司（61301-33-5；10 mg）；脂多糖（LPS）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

小鼠心肌細胞HL-1購自美國ATCC公司。DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養基購自美國Gibco公司；辣根過氧化酶（HRP）標記山羊抗體兔IgG購自美國Santa Cruz公司；抗微管蛋白（Tubulin）兔單克隆抗體、Caspase1兔多克隆抗體、消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔多克隆抗體均購自美國CST公司；抗NLRP3兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；蛋白電泳、轉膜與曝光系統均購自美國Bio-rad公司；IL-1β、HMGB1、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒均購自美國eBioscience公司；小鼠GSDMD特異性siRNA購自上海吉瑪制藥技術有限公司；脂質體2000（Lipofectamine 2000）購自美國Invitrogen公司。

2 方 法

2.1 SchC的配制

將SchC粉末用DMSO配制成5、10、20、50、100、150、200 mmol·L-1；MTT實驗時，加入1 μL各濃度SchC至100 μL培養基中（DMSO濃度為1%）；其余實驗，加入1 μL各濃度SchC至1 mL培養基中（DMSO濃度為0.1%）。

2.2 HL-1細胞培養

將HL-1細胞接種到DMEM高糖培養基（含100 μ·mL-1鏈霉素、100 μ·mL-1青霉素和10%胎牛血清）中培養，每48 h換液1次，2～3 d傳代1次，傳代2次取生長良好的細胞用于實驗。

2.3 MTT法預實驗選定SchC濃度

分別取對數生長期HL-1細胞接種于96孔板中，分別加入0、5、10、20、50、100、150、200 μmol·L-1的SchC，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h。

2.4 分組

①將HL-1細胞分組，設立對照組、LPS（1 mg·L-1）組、LPS（1 mg·L-1）+SchC（5、10、20 μmol·L-1）組，SchC孵育細胞1 h后再經LPS處理24 h、48 h，收集細胞上清液進行ELISA，收集細胞進行Western blot和MTT實驗；②將HL-1細胞分組，設立對照組、LPS（1 mg·L-1）組、siGSDMD組、LPS（1 mg·L-1）+siGSDMD組、LPS（1mg·L-1）+siGSDMD+SchC（20μmol·L-1）組，HL-1細胞經GSDMD的siRNA（10 nmol·L-1）處理細胞24 h后再經SchC孵育1 h，最后用LPS處理細胞24 h，收集細胞上清液進行ELISA，收集細胞進行MTT實驗。

2.5 MTT法檢測細胞增殖情況

采用MTT法，選取對細胞增殖影響小的SchC濃度組進行后續實驗。①分別取對數生長期HL-1細胞接種于96孔板中，分別加入5、10、20 μmol·L-1的SchC提前孵育1 h后，加入LPS（1 mg·L-1）處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h或48 h；②分別取對數生長期HL-1細胞接種于96孔板中，GSDMD特異性siRNA處理HL-1細胞24 h后SchC再孵育1 h，加入LPS（1 mg·L-1）處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h或48 h。每孔加人20 μL MTT（5 mg·mL-1）繼續培養4 h，離心后小心吸盡上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混勻，采用酶標儀于570 nm處讀取各孔吸光度值。按公式AX/ADMSO計算細胞增殖抑制率。

2.6 ELISA檢測細胞IL-1β、HMGB1和TNF-α的表達

細胞因子（IL-1β、HMGB1和TNF-α）水平檢測：按照3×106個/皿將HL-1細胞接種在6孔板中，給予藥物后孵育1h，加入1mg·L-1LPS，24h后收集細胞上清液，并檢測細胞蛋白濃度。96孔ELISA板包被細胞因子的捕獲抗體，4 ℃過夜。次日，運用含0.1‰吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3次，吸水紙拍干剩余液體，用BSA封閉含有抗體的ELISA板1 h，加入細胞培養上清液，室溫孵育2h。2h后運用PBST洗滌3次，加入細胞因子的檢測抗體，室溫孵育1 h。1 h后運用PBST洗滌3次，加入Strapavaidin-HRP，室溫孵育30 min。隨后加入HRP顯色底物（TMB）室溫避光孵育15 min。15 min后加入終止緩沖液（4%H2SO4），運用酶標檢測儀于450 nm處檢測吸光度。

2.7 Western blot檢測細胞Caspase1、GSDMDN端和NLRP3的表達

細胞裂解后，測定蛋白濃度并配平每個蛋白的上樣量。等量蛋白通過SDS膠進行分級分離，然后濕法轉移至PVDF膜上，分子量小的用0.2 μm孔徑的膜，分子量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進行封閉，待封閉好后加入一抗（抗Caspase1兔多克隆抗體、抗GSDMD兔多克隆抗體、抗NLRP3兔多克隆抗體和抗Tubulin兔單克隆抗體，稀釋均為1∶1000），置室溫搖床孵育2 h后移至4 ℃搖床過夜。次日加入HRP結合的二抗（1∶3000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，用曝光儀成像。

2.8 siRNA誘導的基因沉默

利用特異性siRNA序列實現細胞內的基因沉默。采用Lipofectamine 2000將10 nmol·L-1的siRNA轉染至HL-1細胞，具體操作根據說明書指示進行。

2.9 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用Student’s t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 低劑量的SchC不影響HL-1細胞增殖

MTT法檢測各濃度對HL-1細胞增殖的影響。結果顯示，100 μmol·L-1及以上濃度的SchC可明顯抑制HL-1細胞增殖（P<0.01），見圖1。表明高濃度SchC對HL-1細胞有著細胞毒性作用，可能會影響后續實驗，故只使用5、10、20 μmol·L-1濃度的SchC。

3.2 SchC劑量依賴性抑制LPS引起的HL-1細胞活力

MTT實驗結果顯示，在LPS（1 mg·L-1）處理24 h或48 h條件下，與對照組相比，LPS組HL-1細胞活力明顯下降（P＜0.01），而SchC可劑量依賴性改善LPS誘導的HL-1細胞活力下降，見圖2A～B。表明SchC可緩解LPS誘導的HL-1細胞活力下降。

3.3 SchC抑制LPS誘導的細胞焦亡

不同濃度SchC（5、10、20 μmol·L-1）預先處理HL-1細胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激細胞24 h后收集細胞培養基上清液檢測炎癥細胞因子IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平。結果顯示，與對照組相比，LPS可上調IL-1β、HMGB1和TNF-α 的分泌水平，經SchC處理后，HL-1細胞的IL-1β、HMGB1、TNF-α 的分泌水平降低，且SchC濃度越大，其抑制效果越佳，見圖3A～C。

不同濃度SchC（5、10、20 μmol·L-1）預先處理HL-1細胞1 h后，LPS（1 mg·L-1）刺激細胞24 h后收集細胞、檢測活化的炎性半胱天冬酶（cleaved-Caspase1）和GSDMD-N端的蛋白表達。實驗結果顯示，與對照組相比，LPS可上調cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表達，經SchC處理后，HL-1細胞的cleaved-Caspase1、GSDMD-N端和NLRP3的蛋白表達呈劑量依賴性降低，見圖4A～D。表明SchC可降低LPS誘導的細胞焦亡。

3.4 SchC通過減少細胞焦亡緩解LPS引起的HL-1細胞活力下降

后續為確證SchC通過減少細胞焦亡緩解LPS引起的細胞活力下降。利用siRNA沉默HL-1細胞的GSDMD的表達后，SchC預處理1 h，再用LPS處理24 h，結果發現沉默GSDMD后，LPS引起HL-1細胞的IL-1β 水平有明顯降低，但SchC預處理組與siGSDMD＋LPS組相比并無統計學差異，見圖5 A～B；MTT實驗結果顯示，沉默GSDMD后，LPS引起的HL-1細胞活力有明顯上升，但SchC預處理組與siGSDMD＋LPS組相比并無統計學差異，見圖5C。表明SchC可能通過減少細胞焦亡緩解LPS引起的細胞損傷。

4 討論

現已證明，內毒素在機體的膿毒性反應中起著觸發劑的作用，在激活的連鎖反應中，細胞因子可能起核心作用[7]。研究報道，LPS引起小鼠心臟炎癥反應及細胞凋亡與焦亡，從而導致小鼠心功能異常[3，8]。近年來，研究發現細胞焦亡與感染性疾病、自發炎癥性疾病和自身免疫性疾病等密切相關[9-11]。在細胞焦亡發生初期，通過識別LPS等細胞外感染源，激活NF-κB信號通路，促進炎癥小體NLRP3活化以及pro-Caspase家族蛋白、pro-IL-1β 和pro-IL-18的轉錄合成，而后依賴Caspase家族蛋白剪切上述蛋白前體與執行蛋白GSDMD，從而激活細胞焦亡。其中GSDMD在細胞焦亡過程中起著執行者的角色，測定炎性半胱天冬酶（Caspase）通過剪切GSDMD形成含有GSDMD-N端活性域的肽段，以及IL-1β 和IL-18等細胞因子的水平，可以從一定程度反應機體的焦亡過程和炎癥水平。目前應用于臨床的治療膿毒癥心肌損傷的藥物很少，由細胞焦亡在膿毒癥誘發心肌損傷的重要性出發，對尋找新的治療藥物有著重要意義。

五味子丙素（SchC）是五味子的一種二苯并環辛二烯衍生物，被證明能夠緩解脂磷壁酸刺激小膠質細胞和痤瘡丙酸桿菌、引起巨噬細胞的細胞炎癥[7，8]。本研究發現，通過LPS誘導小鼠心肌細胞24 h后，炎癥因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平顯著升高。當給予SchC預處理心肌細胞1 h后發現，炎癥因子IL-1β、TNF-α、HMGB-1的分泌水平明顯降低，這說明SchC是通過抑制炎癥因子的分泌、緩解LPS誘導過程心肌損傷。由Western Blot實驗顯示，LPS刺激小鼠心肌細胞24 h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平顯著升高，SchC預處理LPS刺激的小鼠心肌細胞1h后，Cleaved-Caspase1、GSDMD-N端、NLRP3的蛋白水平呈劑量依賴性降低。這預示著SchC的抗細胞損傷活性可能是由于降低了細胞焦亡的激活。為進一步驗證這一設想，后續實驗采用GSDMD的siRNA沉默心肌細胞的GSDMD表達，繼而用SchC處理細胞后LPS刺激細胞24 h，結果顯示，SchC在GSDMD缺失的情況下，無法發揮其抗炎和抗細胞損傷作用，表明SchC對LPS誘導的炎癥反應和細胞損傷的緩解作用源自其對細胞焦亡的抑制活性。

綜上所述，本研究表明，SchC能有效抑制LPS誘導的心肌細胞焦亡的激活而緩解心肌細胞損傷，這可能是一個有效治療膿毒癥心肌損傷和緩解心功能異常的有效單體成分。