同型半胱氨酸降低銜接蛋白P66Shc DNA甲基化狀態引起血管內皮損傷

張毛帥，貴英英，李慧丹，梁萬前，李建華，林 飛，王學惠 (新鄉醫學院第一附屬醫院，河南 衛輝 453100)

流行病學和臨床研究表明，高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteine，HHcy)是致心血管疾病的一個獨立危險因素[1-2]。在HHcy致心血管疾病的機制中， Hcy導致血管內皮細胞損傷是其中一個重要的因素[3]。研究表明P66Shc甲基化狀態的改變，可引起血管內皮細胞損傷[4]。Hcy能否改變P66Shc甲基化狀態，引起血管內皮細胞損傷，研究報道較少。本研究以體外培養人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為研究對象，觀察Hcy對細胞P66Shc DNA甲基化狀態的影響及DNA甲基化狀態改變后對血管內皮細胞凋亡的影響，為DNA甲基化介導Hcy致血管內皮損傷提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料：人臍靜脈內皮細胞(Sciencell，美國Catalog Number 8000 Lot Number 15482 CA Number 0002748)、內皮細胞培養基(Sciencell，美國)；同型半胱氨酸(Sigma，美國)；P66Shc antibody(武漢三鷹，中國)；Caspases-3抗體、兔二抗(Abcam，美國)；DNA提取試劑盒、DNA甲基化試劑盒(康為世紀，中國)；5-氮雜胞嘧啶核苷5-Azacytidine(Sigma，美國)，TUNEL試劑盒(碧云天，中國)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測細胞活性： 培養HUVECs融合約至80%，傳代至96孔板，4 000細胞/孔，第2天加入不同濃度的Hcy。應用MTT法檢測不同濃度Hcy孵育24 h后HUVECs的活性。

1.2.2TUNEL染色檢測細胞凋亡：根據TUNEL試劑盒說明書[4%多聚甲醛固定、細胞通透、制備TUNEL反應混合液、標記反應、終止反應、封閉POD、酶標反應、DAB顯色(避光)、蘇木素復染]觀察Hcy和5-Azacytidine處理后臍靜脈血管內皮細胞凋亡情況。

1.2.3檢測Hcy處理HUVECs中蛋白表達：培養HUVECs融合約至80%，傳代至6孔板，分別加入終濃度為 0 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L，200 μmol/L的Hcy，孵育24 h后，提取蛋白。應用WesternBlot技術檢測P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達水平。

1.2.4DNA的提取及DNA甲基化特異性PCR：采用DNA提取試劑盒，提取誘導后HUVECs中的DNA。應用DNA甲基化修飾試劑盒進行甲基化修飾。依次把12.5 μl Taq mix、1.25 μl甲基化及1.25 μl未甲基化上下游引物、1 μl處理后DNA、9 μl超純水加入250 μl PCR管中。PCR儀按照95 ℃ 10 mins、95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s、Tm=2 ℃(A+T)+4 ℃(G+C)循環35次，72 ℃ 7 mins退火。并制備1%瓊脂糖凝膠，在254nm波長的透射紫外燈下觀察。P66Shc甲基化引物：上游引物：5′-TTTTCGTTTTTTGGGTTC-3′下游引物: 5′-TACGTATTCCTACCGAACG-3′；P66Shc未甲基化引物：上游引物：5′-TAATTTTTGTTTTTTGGGTTT-3′下游引物: 5′-TACATATTCCTACCAAACACAA-3′。

1.2.5檢測5-Azacytidine處理HUVECs中蛋白表達：培養HUVECs融合約至80%，傳代至6孔板，分別加入終濃度200 μmol/L的Hcy同時加入終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的5-Azacytidine后，應用WesternBlot技術檢測P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達水平。

1.3統計學方法數據：采用Graph-Pad Prism 6.0統計軟件對實驗數據進行處理：兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩組計量資料之間的相關性采用雙變量相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Hcy對HUVECs活性的影響：Hcy對細胞活力影響如圖1所示，隨著Hcy濃度的增加，細胞活力逐漸降低。

2.2Hcy和5-Azacytidine處理后細胞凋亡檢測：如圖2所示： 與對照組相比，Hcy處理后細胞凋亡增加，而加入5-Azacytidine處理后，可以明顯減輕細胞的凋亡。TUNEL染色陽性表現為細胞核呈深棕黃色如箭頭所示。

2.3Hcy處理HUVECs后P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達水平：如圖3所示，與對照組相比，不同濃度Hcy(50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L)處理HUVEC均可以促進P66Shc與active-Caspase-3的表達增加， 且Hcy致HUVECs損傷具有劑量依賴性。

2.4P66Shc特異性甲基化PCR：如圖4所示，P66Shc在對照組中甲基化狀態較強，在Hcy誘導組中未甲基化狀態較強。說明Hcy降低P66Shc DNA甲基化狀態。

*為P<0.05，**為P<0.01

注：A組：對照組 B組：Hcy組 C組:5-AZA組 D組：Hcy+5-AZA組

*為P<0.05,**為P<0.01

圖4 各組處理細胞中P66Shc甲基化檢測電泳圖

2.55-Azacytidine處理HUVECs后P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達水平：如圖5所示，與單加200 μmol/L Hcy處理組相比，加入不同濃度5-AZA(10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)處理細胞后，均能降低P66Shc、active-Caspase-3蛋白表達水平，并且隨著5-AZA濃度的增加而逐漸減少。

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎，其發生發展常常造成嚴重心血管事件的發生。研究結果顯示，HHcy是致冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素[5]。HHcy導致冠狀動脈粥樣硬化發生的機制包括細胞氧化應激、內質網應激、線粒體應激反應與凋亡、血管炎性反應、細胞凋亡及血管內皮細胞損傷等[6-7]。其中HHcy致血管內皮損傷是導致心血管疾病的獨立預測因子。在HHcy致心血管疾病進展的機制中，Hcy導致血管內皮細胞損傷是較為重要的因素[8]。

*為P<0.05，**為P<0.01

近年來研究發現表觀遺傳學修飾影響各類疾病的發生、發展，其機制為在基因序列不發生改變情況下，導致基因表型變化。L.Duan等報道[9]表觀遺傳學修飾與冠狀動脈粥樣硬化關系密切。在表觀遺傳學修飾引起血管內皮細胞損傷機制中，DNA甲基化能夠抑制轉錄因子轉錄，進而引起血管內皮細胞損傷[10]。在人組織樣本和小鼠模型中已經證實DNA低甲基化能夠促進動脈粥樣硬化的發生與發展[11-12]。Hcy參與蛋氨酸循環的轉甲基代謝，可以改變蛋白組及DNA的甲基化狀態[13]。這樣在表觀遺傳學修飾層面上，解釋了Hcy致冠狀動脈粥樣硬化的機制。

銜接蛋白P66Shc能夠調節細胞凋亡，是影響哺乳動物應激凋亡反應調控通路的一部分。銜接蛋白P66Shc通過其氧化還原酶活性刺激線粒體活性氧 (ROS)的產生以及一氧化氮(NO)損耗，加重血管內皮損傷，在動脈粥樣硬化的病理生理過程中起著重要作用[14-15]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者的外周血單核細胞(PBM)中，P66ShcmRNA表達與血清低密度脂蛋白膽固醇和Hcy水平呈顯著正相關[16]。另外P66Shc能夠介導Hcy誘導ROS功能失調及內皮細胞凋亡[17]。甲基化轉移酶抑制劑5-AZA能夠抑制血管內皮炎性損傷及動脈粥樣硬化的發展[18]。

筆者探討DNMT3b抑制劑的5-AZA是否能夠抑制P66Shc的表達并減少血管內皮細胞凋亡。本實驗結果表明Hcy誘導HUVECs凋亡，促進P66Shc的表達，引起血管內皮細胞損傷。驗證了P66Shc調節血管內皮細胞損傷的作用。另active-Caspase3是反映細胞凋亡的關鍵指標，能夠反映血管內皮損傷程度，在Hcy致血管內皮損傷中起到監測作用[7]。檢測active-Caspase3表達程度能夠間接反應P66Shc對血管內皮損傷的作用[19]。本實驗采用特異性甲基化檢測Hcy誘導P66Shc甲基化狀態變化及細胞凋亡程度的改變，判斷血管內皮細胞損傷程度。結果顯示：Hcy誘導P66Shc低DNA甲基化狀態及active-Caspase3蛋白表達增加，而5-Azacytidine抑制P66Shc及active-Caspase3蛋白表達。說明Hcy致 P66Shc的DNA低甲基化,使血管內皮細胞凋亡產生血管內皮損傷。但考慮5-AZA為DNA甲基化轉移酶抑制劑，理論上會降低P66Shc啟動子區甲基化而升高其表達，但結合文獻報道及本實驗結果考慮可能存在其他結合位點及轉錄相關蛋白介導引起5-AZA起到血管內皮保護性機制[20-21]。

綜上所述，Hcy能夠降低P66Shc的DNA甲基化,致血管內皮細胞凋亡，產生血管內皮細胞損傷。本實驗明確了Hcy調節DNA甲基化狀態致血管內皮損傷的新機制，為研究Hcy致表觀遺傳學改變提供新的思路。結合DNMTs酶抑制劑-HDACIs已經被作為治療癌癥及血液系統疾病的靶點，筆者相信DNA甲基化等表觀遺傳機制是治療心血管疾病的潛在靶點[22]。結合Hcy通過活化DNMT3b誘導P66Shc的表達，并促進細胞氧化應激的發生進而造成血管內皮損傷。SiRNA技術敲低DNMT3b，進一步驗證P66Shc甲基化程度及改變后血管內皮損傷的程度[23]。另外通過誘導DNMTs表達及P66Shc靶點作用，能為治療Hcy代謝異常及胱硫醚β-合成酶(CBS)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR-C667T )基因突變所致心血管疾病及其他所致疾病提供新的診斷、治療策略。是否存在Hcy改變P66Shc甲基化狀態，進而影響下游靶基因的表達改變使細胞凋亡程度增加，而最終造成血管內皮損傷的形成仍待研究。由于基因內甲基化的提出、DNA甲基化的復雜性、全組DNA甲基化動態變化仍不十分明確，DNA甲基化相關數據及Hcy誘導心血管疾病相關未知機制仍需要繼續探索[24-26]。