骨髓間充質干細胞-生物蛋白膠在關節軟骨缺損修復中的作用研究

余杰鋒，鄺立鵬，張 煒，姚澤明 [遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院，廣東 珠海 519100]

最近幾年，新研發的軟骨組織工程技術，對于軟骨兔關節細胞的缺損修復有了新的方案與想法，對于當前這種技術成為軟骨缺損修復的重點研究對象，軟骨缺損后重新生成可能變成一種現實[1]。本研究擬通過兔自體骨髓間充質干細胞(BMSCs)與自體提取生物蛋白膠復合后是否可以使兔膝關節軟骨缺損部分有效恢復，并觀察其遠期的修復效果,這可能會使得修復軟骨組織細胞的來源變得更加方便，尋找合理的實驗支架材料，并為軟骨組織工程技術的臨床應用提供實驗基礎和依據。

1 資料與方法

1.1研究對象：飼養材料與動物的選取：飼養48只普通級別的雌性或者雄性新西蘭兔，體重為1.4～1.5 kg,飼養時的溫度維持在25℃左右，保持濕度約為60%，能夠讓它們自由的活動與飲食，每只兔子都單獨在一個籠子里飼養，定時進行殺菌和更換飼料水，清理完它們的排泄物，保持好飼養籠子的干燥。清潔對兔子的飼養以及所有的實驗操作，受到了國家動物管理局的認可，同時也并不違反倫理[2]。廣東省的一家動物實驗中心配置了對實驗兔子的常規飼養食物。

1.2方法

1.2.1BMSCs 提取、 純化和鑒定：用合理科學的方法將兔BMSCs分離出來，依據細胞形狀的改變情況和查看細胞表面的物質進行鑒定。對于體外培養的干細胞進行同樣的觀察與檢測，觀察其成軟骨、成骨、成脂的分化能力。

1.2.2兔自體血液的獲取及生物蛋白膠的制備：抽取兔動脈血后送第三方生物制劑公司進行蛋白膠提取。

1.2.3兔BMSCs與蛋白膠復合的培養及觀察。

1.2.4兔膝關節軟骨全層缺損動物模型的分組:按隨機分配原則將飼養的48只新西蘭兔均分為4個小組,每組12只,每組有24個膝關節樣本,分別進行4種不同的處理:1組將軟骨切除后再原位進行回植;2組將BMSCs與關節軟骨脫細胞基質復合物修復軟骨缺損;3組單純用脫細胞軟骨基質修復缺損;4組為軟骨部分缺損處不做任何處理。以上各組動物按照嚴格無菌原則操作,進行實驗后3 d再用青霉素注射，避免被細菌感染,周期性的處理實驗切口。

1.3術后觀察指標

1.3.1術后觀察兔子的基本生活情況:每天檢查實驗后兔子的走路情況、精神變化、身體姿勢、傷口恢復情況、飲食情況、走動情況[3-4]。

1.3.2大體標本觀察:在進行實驗后的4周、8周、12周內在每一小組中減少4只兔子。大體查看兔子包括關節面在內的左股骨遠段。用眼睛看軟骨缺損修復變化情況,包括軟骨缺損修復程度，修復組織是否是透明軟骨及其色澤，與周邊組織及軟骨下骨的整合度，有無裂縫及硬化，有無骨贅形成及滑膜反應等并拍照。根據改良的Pineda法評分標準評分[5]。

1.3.3標本組織學檢測：常規HE染色觀察修復組織的一般情況，用甲苯胺藍測來檢測糖胺多糖,用Ⅱ型膠原免疫組化染色來檢測Ⅱ型膠原。

1.3.4術后每天對其雙側膝關節活動度進行對比測定。

2 結果

2.1各組術后觀察指標情況：術后4周,1組原位回植軟骨基本存活,2組中軟骨缺損修復大體已經完成,3組和4組能看到軟骨還有一些凹凸;2組軟骨修復后顯現黃色，且顏色很淺，HE染色可以看到一點幼稚軟骨細胞,且細胞排列很亂,周圍未見典型的陷窩樣結構,可以看到少許基質。實驗后8周,3組軟骨細胞修復基本完成,4組還見小凹陷。2組缺損處修復組織較前增多,顏色呈淡黃色,表面較4周時光滑,彈性充足,與旁邊的軟骨組織分界仍舊存在。實驗12周后1組缺損恢復效果達到與正常一樣,2組缺損恢復過程中出現了顏色變化,與正常軟骨組織的質地表現一樣,HE染色后的軟骨細胞,有著異常的排列方式，軟骨表面有凹陷。3組、4組缺損區基本上都被纖維細胞所圍住,顏色呈現深灰白色,很軟的質地,與旁邊的正常軟骨細胞有著清晰的邊界。

2.2各組各時間點組織切片Wakitani評分:定時通過Wakitani 評分表對實驗結果進行組織學評分,1組、2組在每個時間的修復效果都比3組、4組更好,差異有統計學意義(P<0.05)，表示其恢復效果差別很大;3組、4組這兩個小組對相同實驗時間的兔子軟骨組織恢復效果進行分析，差異無統計學意義(P>0.05)。2組在不同的時間內與其他組的分析比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別時間 細胞形態 與周圍結合軟骨厚度基質染色 總分 1組第28天1.1±0.81.3±0.11.0±0.11.3±0.36.1±1.4第56天0.8±0.10.5±0.10.4±0.80.6±0.63.4±0.4第84天0.3±0.30.6±0.30.3±0.50.3±0.31.1±1.72組第28天1.3±0.11.3±0.11.5±0.11.4±0.45.0±1.5第56天0.7±0.40.6±0.20.7±0.40.5±0.03.1±0.3第84天0.2±0.50.3±0.50.5±0.10.4±0.31.4±1.03組第28天2.1±0.31.3±0.41.6±0.41.9±0.58.0±1.9第56天1.7±0.51.1±0.11.3±0.11.7±0.65.1±0.7第84天1.3±0.60.8±0.61.4±0.01.1±0.73.2±1.84組第28天3.1±0.42.5±0.32.3±0.42.8±0.311±1.1第56天2.3±0.81.7±0.11.9±0.12.5±0.113.7±0.4第84天2.1±0.41.3±0.41.9±0.32.1±0.48.7±1.8

注：每組各時間點關節數量均為8個

3 討論

軟骨組織缺損是一種有著較高病發率的骨科疾病[6]。關節軟骨缺損分為兩種類別，分別是部分缺損和全層缺損[7]。關節軟骨部分缺損對下骨組織不會產生影響。本次研究對BMSCs進行分析，研究復合關節軟骨脫細胞基質在修補兔關節軟骨部中的原理和作用機制,結果顯示可以生產軟骨樣組織修復缺損部位。而單獨應用脫細胞軟骨基質修復缺損部位生成的為纖維組織。軟骨細胞在體內可以由BMSCs誘導形成。隨著關節軟骨損傷的研究越來越深入,將會被廣泛應用于醫學。組織工程技術對骨損傷修復提出重要方案和思路。