乳樣中金黃色葡萄球菌的靶向分離及其致臨床型乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)分析

王登峰，李建軍，劉志強(qiáng)，翁業(yè)斌，葛建軍，楊學(xué)云，吳建勇

(1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830013；2.新疆呼圖壁種牛場(chǎng)有限公司，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意義】奶牛乳腺炎是奶牛的多發(fā)病，我國(guó)臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率在2.3%～16.7%，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是奶牛乳腺炎的主要傳染性致病菌之一[1, 2]。該菌的常規(guī)分離方法是將乳樣接種于5%～7%的綿羊血瓊脂平板過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)菌落的溶血和形態(tài)挑取疑似菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，通過(guò)生化試驗(yàn)或分子生物學(xué)方法進(jìn)行最終鑒定[3, 4]。該方法靶向性差，且平板培養(yǎng)的敏感性低而導(dǎo)致分離率低；為提高靶向性，可以使用分子生物學(xué)方法先對(duì)乳樣進(jìn)行SA檢測(cè)，陽(yáng)性樣本再進(jìn)行常規(guī)方法分離、鑒定[4]，此方法費(fèi)用較高；一些實(shí)驗(yàn)室直接使用CHROM SA顯色培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離、鑒定[5, 6]，但仍存在瓊脂平板培養(yǎng)敏感性低、選擇性培養(yǎng)基價(jià)格普遍高等問(wèn)題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】同時(shí)，SA在臨床型、隱性乳腺炎樣本中的分離率普遍介于30%～50%，隨機(jī)奶樣中的分離率介于20%～50%[1]，表明雖然SA 感染可導(dǎo)致臨床型乳腺炎的發(fā)生，但不是所有感染SA的乳腺必然發(fā)生臨床型乳腺炎[7, 8]，建立準(zhǔn)確評(píng)估SA感染與臨床型乳腺炎發(fā)生的相關(guān)性是控制SA性臨床乳腺炎的重點(diǎn)。已有研究證實(shí)SA感染導(dǎo)致的臨床型乳腺炎與感染菌株的毒力正相關(guān)[9, 10]，所以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)SA毒力是判斷是否導(dǎo)致臨床型乳腺炎發(fā)生的關(guān)鍵。此外，通過(guò)調(diào)查牛場(chǎng)中SA菌群的毒力分布可以評(píng)估養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生臨床型乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。【本研究切入點(diǎn)】目前評(píng)價(jià)細(xì)菌分離株毒力的方法主要是通過(guò)小鼠腹腔注射[3]或肌肉注射[11, 12]純培養(yǎng)物，觀察感染后小鼠死亡數(shù)量、死亡時(shí)間和病變程度等進(jìn)行評(píng)價(jià)，該方法雖然簡(jiǎn)單、直觀，但是對(duì)于毒力差異較大，中、弱毒力菌株小鼠致死率較低的SA菌株，用該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)則比較困難，并且需要耗費(fèi)大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用也較高。研究建立可以定量測(cè)定SA主要致病因子溶血素的分泌量，進(jìn)而評(píng)價(jià)菌株毒力的方法。【擬解決的關(guān)健問(wèn)題】使用葡萄球菌選擇培養(yǎng)基mBP培養(yǎng)液結(jié)合CHROM SA顯色培養(yǎng)基對(duì)乳樣中的SA進(jìn)行靶向分離，結(jié)合定量測(cè)定SA主要致病因子溶血素進(jìn)而評(píng)價(jià)菌株毒力的技術(shù)，建立可適用于生產(chǎn)的SA感染情況調(diào)查和致臨床乳腺炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

根據(jù)臨床檢查或隱性乳腺炎檢查法(CMT法)[13]檢測(cè)結(jié)果，初步判斷患臨床型、隱性乳房炎奶牛和健康泌乳牛(SCC<30萬(wàn))。以常規(guī)擠奶法棄掉前3把奶，用常規(guī)消毒液消毒乳頭及其附近區(qū)域，再用酒精棉球消毒乳頭。打開(kāi)滅菌試管蓋，將試管保持水平狀態(tài)，將奶樣擠入試管中，蓋好試管蓋，冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

2017年8～12月間，選取新疆昌吉州4個(gè)千頭規(guī)模的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，共采集未經(jīng)治療的臨床型乳腺炎乳樣64份、隱性乳腺炎乳樣(SCC≥30萬(wàn))157份和健康乳樣(SCC<30萬(wàn))213份[14]。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

葡萄球菌選擇培養(yǎng)液為mBP 培養(yǎng)液[15-16]，配方專利檢索號(hào)為(200610038812.0)，具體配制過(guò)程為：先將10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g丙酮酸鈉、12 g甘氨酸、5 g氯化鋰完全溶解于980 mL水中，再用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.3，然后，于121℃下滅菌，冷卻至(50±10)℃時(shí)加入無(wú)菌1%亞碲酸鉀溶液10 mL和7 mL吐溫80，5 mL滅菌管，無(wú)菌分裝為2 mL/支，4℃保存。

科碼嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基(CHROM SA培養(yǎng)基)購(gòu)自北京賽為思生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，配制方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基配制：哥倫比亞液體培養(yǎng)基(Gibco干粉培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，添加1.5%氯化鈉，用0.1 moL/L氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5，在0.11 MPa壓力下滅菌20 min ，冷卻至(45～50℃)，按10%比例添加小牛血清(四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司)混勻，10 mL滅菌管，無(wú)菌分裝為2 mL/支，4℃保存。

1.2.2 選擇性分離培養(yǎng)

采集的奶樣顛倒混勻后取100 μL接種 mBP 培養(yǎng)液中顛倒混勻，37℃培養(yǎng)18～24 h ，選擇培養(yǎng)液明顯渾濁并有黑色產(chǎn)物培養(yǎng)管，取50 μL涂布或劃線接種于科碼嘉金葡菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，SA菌落表現(xiàn)為紫紅色、紅色、粉紅色；挑取單菌落接種于改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基于37℃、150 r/min振搖培養(yǎng)20 h。

1.2.3 金黃色葡萄球菌毒力的快速評(píng)估

金黃色葡萄球菌分泌性溶血素的測(cè)定參見(jiàn)《一種可定量測(cè)定細(xì)菌分泌性溶血素活性的測(cè)定方法》，申請(qǐng)?zhí)枺?01710342810.9[17]。

1.2.3.1 試劑配制

貯存液：十二水磷酸氫二鈉 2.85 g、磷酸二氫鉀 0.27 g、氯化鈉17.00 g、加蒸餾水至100 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾后，4℃保存。

應(yīng)用液：5 mL貯存液加95 mL蒸餾水，再加10%硫酸鎂0.1 mL，12 h內(nèi)使用。

血細(xì)胞保存液：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，氯化鈉0.42 g，蒸餾水100 mL，以上成分混勻后，微加溫溶解后，用檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH至6.1，并分裝在三角瓶中，115℃濕熱滅菌15 min。

1%綿羊紅細(xì)胞制備：無(wú)菌采取綿羊血液在等量的血細(xì)胞保存液中。使用前用3到10倍體積的應(yīng)用液洗3次。1 500 r/min，前2次離心5 min，最后一次離心10 min。吸棄上清液，并使用應(yīng)用液制成1%的細(xì)胞懸液。

1.2.3.2 毒力評(píng)價(jià)

使用定量測(cè)定SA分泌性溶血素活性的方法[17]對(duì)分離株進(jìn)行毒力評(píng)估，可選用試管法和微孔法，試驗(yàn)采用微孔法，詳細(xì)操作如下：

待測(cè)樣本準(zhǔn)備：金黃色葡萄球菌分離株單菌落經(jīng)改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基150 r/min振搖培養(yǎng)20 h后，取培養(yǎng)物1 mL，以8 000×g離心5 min，取500 μL上清，4℃可保存24 h，-80℃可保存60 d。

細(xì)菌溶血素量微孔法測(cè)定操作：

(1)稀釋毒素：待測(cè)毒素50 μL，應(yīng)用液5 mL，稀釋度為1∶100。

(2)配制溶血標(biāo)準(zhǔn)孔：1%綿羊紅細(xì)胞800 μL加1 200 μL蒸餾水，混勻，即為全溶血孔，取250 μL加入全溶血孔。取全溶血孔液600 μL加應(yīng)用液600 μL，即為50%溶血孔，取250 μL加入50%溶血孔，并使用同體積的應(yīng)用液作空白對(duì)照孔。

(3)稀釋的待測(cè)毒素、緩沖液和紅細(xì)胞依次加入反應(yīng)孔中(“V”型底微孔板較為合適)，混勻，置37℃水浴30 min。第0管為非溶血對(duì)照孔。每個(gè)孔做3個(gè)以上復(fù)孔。表1

表1 微孔法測(cè)定細(xì)菌毒素VH50Table 1 Bacterial toxin VH50 determined by microplate method

(4)結(jié)果測(cè)定：取出微孔板，800×g離心5 min，另取“U”型底微孔板，每孔吸取100 μL 到對(duì)應(yīng)的“U”型底微孔板中，對(duì)照孔應(yīng)不溶血。用分光光度計(jì)測(cè)(波長(zhǎng)542 nm)OD值，計(jì)算復(fù)孔平均值，確定與標(biāo)準(zhǔn)50%溶血孔第1接近孔為終點(diǎn)孔，與終點(diǎn)孔緊鄰且與標(biāo)準(zhǔn)50%溶血管的OD542值第2接近孔為次終點(diǎn)孔，根據(jù)終點(diǎn)孔和次終點(diǎn)孔建立Y(OD542值)=aX(待測(cè)毒素添加量)+b線性方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)50%溶血管的OD542值計(jì)算待測(cè)毒素用量。然后按下公式計(jì)算VH50值：

細(xì)菌溶血素量(VH50 U/mL)=(1,00/毒素用量)×稀釋度。

乳樣中分離的SA單菌落接種于2 mL改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基于37℃、150 r/min振搖培養(yǎng)20 h后，培養(yǎng)上清中的溶血素量普遍在300～3 000 VH50 U/mL[17]，結(jié)合小鼠的毒力評(píng)價(jià)試驗(yàn)[18]，初步確定：溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL為強(qiáng)毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL為中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL為弱毒力菌株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)(Spearman correlation coefficient)分析菌株毒力與臨床型、隱性乳房炎和健康泌乳牛樣本之間的關(guān)系。計(jì)算公式為：

其中，n為樣本數(shù)，di=xi-yi.

2 結(jié)果與分析

研究表明,乳樣經(jīng)葡萄球菌選擇培養(yǎng)液(mBP培養(yǎng)液)培養(yǎng)，呈現(xiàn)明顯渾濁并有黑色產(chǎn)物的試管表明樣本中存在葡萄球菌，臨床型乳腺炎乳樣、隱性乳腺炎乳樣和健康乳樣中mBP培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為64.1%、47.9%和20.2%。將mBP陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)一步劃線接種到CHROM SA顯色培養(yǎng)基，SA菌落顏色為紫紅色、紅色、粉紅色。經(jīng)過(guò)靶向分離，分別從采集的3類樣本中分離出SA菌株27株、21株和17株，分離率為42.2%、13.4%和8.0%。表2

挑取CHROM SA顯色培養(yǎng)基上陽(yáng)性單菌落接種于改良哥倫比亞液體培養(yǎng)基，按照設(shè)定條件培養(yǎng)后，使用微孔法測(cè)定各菌株的溶血素分泌量，并將溶血素分泌量設(shè)定為3個(gè)范圍：≥1 500 VH50 U/mL、1 000～1 500 VH50 U/mL和<1 000 VH50 U/mL，分別對(duì)應(yīng)為強(qiáng)毒力、中等毒力和弱毒力。結(jié)果顯示分離于3種類型的樣本中，溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL的菌株分別為9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000～1 500 VH50 U/mL的菌株：1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量在<1 000 VH50 U/mL的菌株：2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。經(jīng)斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析，臨床乳腺炎的發(fā)生與溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(ρ=0.5，P=0.006 7)和≥1 000 VH50 U/mL(ρ=1，P=0.006 9)的SA(中、強(qiáng)毒力菌株)感染呈極顯著正相關(guān)；與溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL的SA(中毒力菌株)感染呈顯著正相關(guān)(ρ=0.5，P=0.021)，與溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL的SA(弱毒力菌株)感染呈不顯著負(fù)相關(guān)(ρ=-1，P=0.10)。

表2 不同類型乳樣中金黃色葡萄球菌的靶向分離和溶血素量分泌Table 2 Targeted isolation and hemolysin secretion of Staphylococcus aureus in different milk samples

注：1 培養(yǎng)液明顯渾濁并有黑色產(chǎn)物；2 菌落顏色為紫紅色、紅色、粉紅色
Note.1.The culture medium was obviously turbid and had black products; 2.The colony color was purplish red, red or pink

3 討 論

金黃色葡萄球菌(SA)是奶牛乳腺炎的主要傳染性致病菌之一，該菌的常規(guī)分離方法較多[19, 20]，研究中使用葡萄球菌選擇培養(yǎng)基mBP 培養(yǎng)液進(jìn)行選擇性增菌，由于mBP培養(yǎng)液分離SA的靈敏度為60個(gè)細(xì)菌[15]，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后，再使用CHROM SA顯色培養(yǎng)基進(jìn)行單菌落分離使分離效率較大提高，也降低了費(fèi)用，適合奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中SA感染調(diào)查。同時(shí)建立快速測(cè)定細(xì)菌分離株溶血素產(chǎn)量的毒力評(píng)價(jià)方法，不依賴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)分離株的毒力評(píng)估感染牛發(fā)生臨床型乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。

金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生溶血毒素、腸毒素、血漿凝固酶、耐熱核酸酶等毒素，產(chǎn)生毒素量和生物活性的差異使不同菌株的致病力差異較大[21-23]，其中溶血素是SA的主要毒素之一[23]。細(xì)菌分泌的溶血素可以溶解(穿孔)綿羊血紅細(xì)胞，當(dāng)紅細(xì)胞和溶血素量一定時(shí)，在規(guī)定反應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，溶血程度與溶血素量和生物活性呈正相關(guān)。在接近50%的紅細(xì)胞溶血(VH50)時(shí)，二者之間近似直線關(guān)系，由此定義引起1 mL，1%濃度的完整綿羊紅細(xì)胞中50%的細(xì)胞溶血所需的最小毒素量為一個(gè)VH50 U，據(jù)此計(jì)算出待測(cè)細(xì)菌液體培養(yǎng)時(shí)上清中分泌的溶血素的量。在相同的培養(yǎng)條件下，可以通過(guò)比較相同細(xì)菌數(shù)量的溶血素產(chǎn)量確定不同分離株的毒力差異。研究結(jié)合小鼠后肢肌肉攻毒、根據(jù)病變指數(shù)評(píng)分的毒力評(píng)價(jià)試驗(yàn)[18]，初步確定：SA溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL為強(qiáng)毒力菌株，溶血素分泌量介于1 000～1 500 VH50 U/mL為中等毒力菌株，溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL為弱毒力菌株。

目前，淘汰SA感染導(dǎo)致的臨床型乳腺炎患病牛，逐步根除SA在牛群中的感染是控制奶牛乳腺炎的重要方案。在我國(guó)，SA 在臨床型、隱性乳腺炎樣本中的分離率普遍介于30%～50%，隨機(jī)奶樣中的分離率介于20%～50%[1]，表明該方案對(duì)大部分牛場(chǎng)并不適用。臨床乳腺炎的發(fā)生與微生物的感染、擠奶等物理因素和奶牛自身的遺傳等多種因素相關(guān)，研究采用斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)(ρ)分析臨床乳腺炎和不同溶血素分泌量菌株的相關(guān)性。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)(ρ)是反映兩組變量之間聯(lián)系的密切程度，ρ∈(1，-1)，當(dāng)ρ=1時(shí)表示臨床乳腺炎和溶血素分泌量秩次完全相同；當(dāng)ρs=-1時(shí)，表示兩者的秩次完全相反；當(dāng)ρs=0時(shí)，則兩者不相關(guān)。對(duì)臨床型乳腺炎乳樣、隱性乳腺炎乳樣和健康乳樣中分離的SA使用建立的方法進(jìn)行定量溶血素測(cè)定，經(jīng)斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，臨床乳腺炎與感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、強(qiáng)毒力)菌株比例的秩次完全一致(P=1)，即呈正相關(guān)；與溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株感染比例的秩次完全相反(P=-1)，即呈負(fù)相關(guān)。一旦感染乳腺中分離出中、強(qiáng)毒力SA，其發(fā)生臨床型乳腺炎的風(fēng)險(xiǎn)較大；同時(shí)，根據(jù)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中SA的感染數(shù)據(jù)和菌群中、強(qiáng)毒力菌株的流行情況可以初步預(yù)測(cè)臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率。

對(duì)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，每年使用該方法開(kāi)展1～2次的SA感染率和菌群毒力調(diào)查，對(duì)中、強(qiáng)毒力菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，可初步預(yù)測(cè)臨床型奶牛乳腺炎的年頭發(fā)病率，使用篩選的敏感抗生素治療可減小乳腺炎的治療周期和提高治愈率，并且通過(guò)徹底治愈、殺滅患病牛攜帶的耐藥菌株，減少耐藥株的擴(kuò)散。

研究未考慮不同菌株增殖速度的差異，未計(jì)算相同細(xì)菌數(shù)量時(shí)的溶血素產(chǎn)量。在建立測(cè)定溶血素量的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在相似的接種量(單菌落)和一致的培養(yǎng)條件下，同一菌株的測(cè)試結(jié)果比較穩(wěn)定，不同菌株的細(xì)菌數(shù)量有差異，但其導(dǎo)致的各菌株的溶血素量測(cè)定結(jié)果與相同細(xì)菌數(shù)量下測(cè)定的結(jié)果相比，變化范圍絕對(duì)值介于10～100 VH50 U/mL[17]，不影響毒力的判斷。方法中采集的各種類型的乳樣數(shù)量和與各類型樣本相關(guān)聯(lián)的SA菌株數(shù)量仍較少，需要在臨床上進(jìn)一步補(bǔ)充樣本量。

4 結(jié) 論

建立了葡萄球菌選擇培養(yǎng)基結(jié)合CHROM SA顯色培養(yǎng)基高敏感度(60 cfu)靶向分離乳樣中金黃色葡萄球菌的方法，并建立了定量測(cè)定分泌性溶血素評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌毒力的方法，金黃色葡萄球菌性臨床型乳腺炎的發(fā)生與感染中、強(qiáng)毒力菌株(溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL)呈正相關(guān)，與感染弱毒力(溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL)菌株呈負(fù)相關(guān)。