蛙皮素樣肽家族及其受體氨基酸序列信息學(xué)比較分析

趙樹林，李璐璐，孫小燕，阿迪萊·艾力，趙紅瓊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】蛙皮素(Bombesin)最早分離于Bombina蛙皮膚，是一種由14個(gè)氨基酸組成的多肽，具有促進(jìn)胃液分泌的作用[1,2]。將與蛙皮素C-端氨基酸具有同源性的多肽稱為蛙皮樣肽(Bombesin-like peptide, BLP)，BLP家族根據(jù)其C-端氨基酸的同源性分為蛙皮素、牛蛙肽(Ranatensin)和葉泡雨濱蛙肽(Phyllolitorin)3個(gè)亞家族[3]，其氨基酸序列比對見圖1，且所有多肽C-端甲硫氨酸被氨基化(-NH2)。【前人研究進(jìn)展】蛙皮素亞家族包括蛙皮素、產(chǎn)婆肽(Alytesin)和胃泌素釋放肽(Gastrin-releasing peptide, GRP)。GRP分離于哺乳動(dòng)物，為27或29個(gè)氨基酸序列，具有促進(jìn)胃泌素分泌的作用，且在哺乳動(dòng)物還發(fā)現(xiàn)了同GRP的C-端10個(gè)氨基酸序列完全相同的神經(jīng)介素C(Neuromedin C, NMC)。牛蛙肽亞家族包括牛蛙肽和分離于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)介素B(Neuromedin B, NMB)等[4]。NMB具有促進(jìn)大鼠平滑肌收縮等作用[5]。【本研究切入點(diǎn)】目前，在哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的BLP家族多肽僅有GRP和NMB，用分別通過GRP受體(GRP-R)和NMB受體(NMB-R)起作用[6]，并且2種受體均為7次跨膜(7-Transmembrane, 7-TM)受體[7]。由于動(dòng)物不同，BLP家族多肽或受體氨基酸序列不同，在進(jìn)行不同動(dòng)物BLP家族多肽功能研究或其相應(yīng)抗體制備過程中，需要關(guān)注目的動(dòng)物BLP氨基酸序列的特異性及其同源性，并進(jìn)行氨基酸信息學(xué)分析比較。針對BLP家族氨基酸信息學(xué)分析的文獻(xiàn)僅見Graham團(tuán)隊(duì)對21種動(dòng)物進(jìn)行了比較[8]，但其主要對BLP家族全肽(例如：PreproGRP)進(jìn)行分析，而未關(guān)注最終起作用的成熟肽，特別是反芻動(dòng)物BLP序列與其他動(dòng)物的不同。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究比較GRP和NMB 2種多肽激素及其受體的氨基酸序列在不同動(dòng)物物種間的差異性，特別是牛等反芻動(dòng)物同其他動(dòng)物之間的序列差異，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為在反芻動(dòng)物進(jìn)行BLP家族多肽結(jié)構(gòu)和功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)分別用“GRP”和“NMB”為關(guān)鍵詞檢索GRP和NMB及其受體的氨基酸序列，當(dāng)檢索到同一個(gè)物種多個(gè)信息數(shù)據(jù)的時(shí)候，標(biāo)記了“Reviewed(引用)”是首先選擇參考的信息數(shù)據(jù)。再用“Align(排列)”功能進(jìn)行牛GRP和NMB多肽或受體蛋白氨基酸序列與其他動(dòng)物序列差異進(jìn)行比較。同時(shí)，比對了牛GRP-R與NMB-R氨基酸序列，并標(biāo)明各自7次跨膜區(qū)域。

1.2 方 法

用1.1篩選出的不同動(dòng)物GRP和NMB及它們各自受體全氨基酸序列，通過DNAstar的Megalign 7.1構(gòu)建GRP和NMB已有全部多肽及受體蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛙皮素樣肽家族氨基酸序列對比

研究表明,蛙皮素、牛蛙肽和葉泡雨濱蛙肽3個(gè)亞家族的不同多肽的氨基酸序列對比，彩色低紋表示高度保守的氨基酸序列，其中C-端甲硫氨酸均被氨基化(-NH2)。圖1

2.2 不同動(dòng)物GRP氨基酸序列比對

牛(Bovine, UniProt 登錄號(hào)Q863C3，下同)27個(gè)氨基酸序列的GRP同其它12種不同動(dòng)物成熟的GRP比對結(jié)果見圖2，這12種動(dòng)物為綿羊(Sheep, P47851)、人(Human, P07492)、豬(Pig, P63153)、豚鼠(Guinea pig, P63152)、狗(Dog, P08989)、虹鱒魚(Rainbow Trout, Q9PS30)、金魚(Goldfish, Q9I8Z9)、馬(Horse, F7DYM4)、小鼠(Mouse, Q8R1I2)、大鼠(Rat, P24393)、雞(Chicken, P01295)、美洲短吻鱷(American alligator, P31886)，其中僅馬和金魚的GRP序列在UniProt中標(biāo)記為“Unreviewed”，其它均為“Reviewed”。由氨基酸序列比對可知，所列13種動(dòng)物C-端8個(gè)氨基酸序列完全相同，牛、羊、人、豬、豚鼠、狗、虹鱒魚、金魚和馬C-端的10個(gè)氨基酸序列(GRP10-27, 即NMC)完全相同，而小鼠、大鼠、雞和美洲短吻鱷C-端10個(gè)氨基酸(NMC)完全相同。牛和綿羊的27個(gè)氨基酸僅在C-端20位氨基酸不同(分別為甘氨酸和丙氨酸殘基)，其他均相同。圖2

注：灰色底紋表示高度保守的氨基酸殘基
Note: Amino acids with gray background showed highly conserved residues

圖1 蛙皮素樣肽家族氨基酸序列對比
Fig.1 Comparison of amino acid sequence among bombesin- like peptide family

在UniProt中用“BLAST”比較牛GRP氨基酸序列(Q863C3, 134個(gè)氨基酸)與其他動(dòng)物已有的全部序列相似性。牛GRP氨基酸序列與綿羊的最接近，為88.7%；其次為豬和豚鼠，兩者相同為77.8%；與狗、鱘鱒魚、馬、美洲短吻鱷、人、小鼠、大鼠、雞的相似性分別為74.1%、73.7%、72.7%、67.9%、63.7%、63.2%、63.2%、63.0%。用“Megalign”構(gòu)建進(jìn)化樹分析GRP已有的全部氨基酸序列顯示，小鼠與大鼠、豚鼠與馬、牛與綿羊、人與狗分別在同一個(gè)分支上，而美洲短吻鱷、雞、虹鱒魚和金魚與哺乳類相距較遠(yuǎn)。圖3

2.3 不同動(dòng)物NMB氨基酸序列比對

研究表明,牛(Bovine, Q2T9U8)、人(Human, P08949)、小鼠(Mouse, Q9CR53)、豬(Pig, P01297)、馬(Horse, F7E042)、狗(Dog, J9NU40)、綠猴(Green monkey, A0A0D9RXD7)、恒河猴(Rehsus macaque, H9EYU4)、金倉鼠(Golden hamster, A0A1U7R215)、揚(yáng)子鱷(Chinese alligator, A0A1U7RLL3)等10種動(dòng)物成熟的32個(gè)氨基酸序列NMB比對情況。牛、人、小鼠和豬GRP在“UniProt”標(biāo)記為“Reviewed”，其它為“Unreviewed”。NMB氨基酸序列比對結(jié)果可知，所列動(dòng)物C-端10個(gè)氨基酸完全相同，而不同區(qū)域主要集中在N-端；同時(shí)，小鼠與金倉鼠、綠猴與恒河猴NMB的32個(gè)氨基酸序列完全一樣。圖4

注：灰色底紋氨基酸殘基表示與牛GRP氨基酸序列比對不同的氨基酸殘基
Note: The amino acids with gray background showed differences compared to bovine GRP

圖2 不同動(dòng)物GRP氨基酸序列比較
Fig.2 Comparison of GRP amino acid sequences in different animals

圖3 不同動(dòng)物GRP氨基酸已有全部序列進(jìn)化樹
Fig.3 Evolution tree of GRP amino acid showed all sequences in different animals

注：灰色背景氨基酸表示與牛NMB氨基酸序列比對不同的氨基酸
Note: The amino acids with gray background show differences compared to bovine NMB

圖4 不同動(dòng)物32個(gè)氨基酸序列的NMB比較
Fig.4 Comparison of 32-amino acid sequence in NMB from different animals

2.4 不同動(dòng)物GRP-R和NMB-R氨基酸序列比較

用“Megalign”構(gòu)建GRP-R全氨基酸序列進(jìn)化樹，包括牛(Bovine, E1BL07)、人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)、狗(Dog, E2QTA7)、豬(Pig, K7GR81)、雞(Chicken, Q802E7)、馬(Horse, F7CVR9)、鴨嘴獸(Duck-billed platypus, F7FDW9)、金倉鼠(Golden hamster, A0A1U7QVZ5)、斑馬魚(Brachydanio rerio, E7F6G4)、美洲短吻鱷(American alligator, A0A151NOH2)。在UniProt數(shù)據(jù)庫僅人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)標(biāo)記為“Reviewed”，其他動(dòng)物標(biāo)記為“Unreviewed”。進(jìn)化樹分析顯示，豬與馬、牛與狗、大鼠與小鼠、雞與美洲短吻鱷分別在同一分支上，而斑馬魚和鴨嘴獸同其它動(dòng)物相距較遠(yuǎn)。“BLAST”分析顯示，與牛GRP-R的氨基酸序列比較相似性最高的為狗(96.1%)，接下來依次為馬、豬、人、金倉鼠、大鼠、小鼠、鴨嘴獸、雞、美洲短吻鱷和斑馬魚，相似性分別為94.3%、94.0%、93.0%、90.9%、90.3%、89.4%、83.9%、82.4%、81.4%和74.9%。圖5

圖5 不同動(dòng)物GRP-R已有全部氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig.5 Evolution tree of GRP-R amino acid showed all sequences in different animals

研究表明,NMB-R氨基酸序列進(jìn)化樹，包括牛(Bovine, E1BMN4)、人(Human, P28336)、大鼠(Rat, P24053)、小鼠(Mouse, O54799)、豬(Pig, B2ZI34)、馬(Horse, F6VCY9)、狗(Dog, E2R9E7)、雞(Chicken, E1BRP1)、鴨嘴獸(Duck-billed platypus, F6Y0D2)和熱帶爪蟾(Western clawed frog, F6PHZ7)。在UniProt數(shù)據(jù)庫中標(biāo)記為“Reviewed”僅有人、小鼠、大鼠。進(jìn)化樹分析顯示，牛與豬、小鼠與大鼠分別在同一個(gè)分支上，雞、鴨嘴獸和熱帶爪蟾與其它哺乳動(dòng)物相距較遠(yuǎn)。“BLAST”分析顯示，對于牛NMB-R的已有氨基酸序列，相似性最高的為豬，達(dá)92.3%；其次為人和馬，分別為91.5%和91.0%；狗、小鼠、大鼠、鴨嘴獸、熱帶爪蟾、雞相似性分別為89.2%、89.0%、88.2%、81.0%，76.3%、72.8%。圖6

圖6 不同動(dòng)物NMB-R已有全部氨基酸序列進(jìn)化樹
Fig.6 Evolution tree of NMB-R amino acid showed all sequences in different animals

從UniProt數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)牛GRP-R(E1BL07)和NMB-R(E1BMN4)氨基酸序列長度分別為384和390個(gè)，相似性為62.2%。從兩2個(gè)受體氨基酸序列比較可知，GRP-R和NMB-R的N-端胞外域分別為1～38和1～48位，C-端胞漿域分別為326～384和328～390位；2種受體7個(gè)疏水的跨膜片段氨基酸位置比較相近，但序列有所差異。圖7

注：灰色底紋氨基酸為跨膜區(qū)域
Note：Amino acid with gray background means the TM region

圖7 牛GRP-R和NMB-R氨基酸序列比較
Fig.7 Amino acid sequences of the bovine GRP-R and NMB-R

3 討 論

研究通過對不同動(dòng)物BLP家族2種多肽GRP和NMB氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同動(dòng)物成熟的GRP和NMB在C-端具有高度保守性，而在N-端區(qū)域變化較大，提示C-端是GRP和NMB的生物活性部位。Zhao等[9]報(bào)道，給犢牛注射27個(gè)氨基酸的牛GRP和10個(gè)氨基酸的NMC(為牛GRP的C-端10個(gè)氨基酸的多肽)均可顯著升高血漿生長激素水平，驗(yàn)證了GRP的生物活性部位在C-端；然而注射NMB卻不能改變犢牛血漿生長激素水平，提示GRP和NMB具有不同的生理功能。目前，公認(rèn)為GRP與GRP-R親和力高，而NMB與NMB-R親和力高[10]。在大鼠大腦中主要是NMB親和性受體，很少一部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)是GRP親和性受體[11]，在食道平滑肌中存在NMB親和性受體[12，13]，而在胰腺細(xì)胞中則是GRP和蛙皮素親和性受體而非NMB親和性受體[14]，提示GRP-R和NMB-R在機(jī)體組織定位不同，也反映出他們具有不同的生理功能。

從氨基酸序列分析不同動(dòng)物GRP或NMB C-端具有高度保守性，例如，反芻動(dòng)物(牛和羊)與人和鼠的GRP在C-端10個(gè)或8個(gè)多肽氨基酸序列完全相同。現(xiàn)在市面上銷售的GRP產(chǎn)品主要為人和鼠多肽，因而在進(jìn)行反芻動(dòng)物GRP多肽功能研究時(shí)，可以選擇人和鼠的GRP多肽用于反芻動(dòng)物的研究。生物信息學(xué)研究表明，不同動(dòng)物GRP-R和NMB-R氨基酸序列也具有高度保守性但不完全相同，在哺乳動(dòng)物之間達(dá)90.0%，哺乳動(dòng)物與鳥類為80.0%，可以預(yù)測不同動(dòng)物的GRP或NMB可以交叉使用，但是可能會(huì)影響其同相應(yīng)受體的親和力，進(jìn)而影響其生物學(xué)效率。

GRP-R和NMB-R 2種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)7-TM受體[7]，在科學(xué)研究中需要制備目的動(dòng)物7-TM受體的抗體時(shí)，在設(shè)計(jì)抗原或半抗原片段時(shí)選擇受體膜外區(qū)域(非跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域)制備的抗體與受體蛋白發(fā)生結(jié)合的可能性大，但是需要檢索所選多肽片段同目的動(dòng)物體內(nèi)其他蛋白的氨基酸序列相似性，以免制備出的抗體特異性低。研究顯示，牛GRP-R和NMB-R 2種受體相似性僅為62.2%，一方面解釋了它們同內(nèi)源性配體(GRP和NMB)親和力不同的原因，另一方面，提醒在設(shè)計(jì)同一目的動(dòng)物這2種受體的抗原時(shí)，要注意其抗原片段相似性。只有2種受體的抗原片段相似性低，制備出的抗體才能特異性地區(qū)別這兩種受體。

4 結(jié) 論

采用生物信息學(xué)分析的方法比較了不同動(dòng)物(特別是反芻動(dòng)物牛)BLP家族GRP和NMB及其受體的氨基酸序列的差異性，GRP或NMB多肽C-端氨基酸序列在不同動(dòng)物之間具有高度的保守性，而其特異性受體(GRP-R或NMB-R)氨基酸序列在哺乳動(dòng)物之間相似性高達(dá)90.0%以上，但牛源這2種受體之間氨基酸序列相似性僅為62.2%，提示其與內(nèi)源性配體親和性不同。