香梨優斑螟脂肪酸Δ9去飽和酶基因序列及不同蟲態的表達分析

王德鋼,馬光皇,賀鵬鵬,熊仁次,曹 玉,張 萍,韓 旭,楊明祿,3

(1.塔里木大學植物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆阿拉爾，843300；3.農業部阿拉爾作物有害生物科學觀測站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】香梨優斑螟(Euzopherapyriella)屬鱗翅目螟蛾科斑螟亞科優斑螟屬[1]，為新疆香梨產區特有的果樹蛀干害蟲。該蟲廣泛分布在新疆烏魯木齊、塔城、博樂、伊寧、昌吉、哈密、吐魯番、庫爾勒和阿克蘇等地，主要寄主有梨、蘋果、無花果、棗、杏、巴旦杏、桃和楊樹等。部分產區被害率高達50%，為害嚴重的，造成樹體的大量死亡[2]，在阿克蘇地區5年以上香梨盛果園內香梨優斑螟危害率達100%，造成嚴重的經濟損失[2]。脂肪中不飽和脂肪酸的比例影響著生物體細胞膜的流動性，在低溫狀態下這種流動性顯得尤為重要，合成不飽和脂肪酸的關鍵酶之一脂肪酸去飽和酶成為研究生物耐寒機制中的熱點。另一方面，脂肪酸去飽和酶在昆蟲性信息素合成中也起到非常重要的作用[3]。研究脂肪酸去飽和酶對昆蟲繁育和生活習性方面有重要作用，對有害昆蟲的成災機制研究有重要意義。【前人研究進展】脂肪酸去飽和酶根據作用底物及結合載體、存在的狀態和引入雙鍵的位置等差異有3種分類方式：(1)根據酶作用的底物以及結合載體的不同，可以分為酰基輔酶A去飽和酶(acyl-CoA FAD)，主要存在于動物及真菌的內質網膜上，作用底物是與CoA結合的脂肪酸；酰基-ACP去飽和酶(acyl-ACP FAD)，存在于植物的葉綠體或質體的基質中，作用底物是與ACP結合的脂肪酸，也是脂肪酸去飽和酶家族唯一可溶性酶；酰基脂肪去飽和酶(acyl-lipid FAD)，主要存在于高等植物和藍藻中，作用底物是以結合脂形式存在的脂肪酸[4]。(2)依據脂肪酸去飽和酶的存在狀態，可分為可溶性蛋白和膜結合蛋白，除了植物的acyl-ACP FAD是唯一可知的可溶性去飽和酶，其余的都是膜結合的FAD[5-6]。(3)根據去飽和過程中引入雙鍵的位置脂肪酸去飽和酶又可分為“前端”去飽和酶和“甲基端”去飽和酶兩類[7-8]。FAD9在真核細胞中是普遍存在的，對調控膜的流動性起著重要作用，其在脂肪酸去飽和酶家族中相對其他基因研究倍受關注。2002年從家蠅(Muscadomestica)體內克隆出FAD9去飽和酶基因[9]，后續從斜紋夜蛾(Ctenopseustisobliquana)等昆蟲的體內克隆了FAD9去飽和酶基因[10]，之后在脂肪酸去飽和酶的研究中在毛眼林蟻(Formicaexsecta)轉錄組中發現了FAD9基因，并認為該基因對螞蟻不同個體之間的相互交流存在非常重要的作用[11]，家蠶轉錄組中也鑒定得到很多脂肪酸去飽和酶基因家族的成員，其中包含FAD9基因[12]。不飽和脂肪酸作為耐寒物質早就被人們所關注，但關于FADs基因與昆蟲耐寒性方面的研究，起步明顯較晚，直到2007年，在蔥蠅(Deliaantique)中首次被證實了脂肪酸去飽和酶Δ9基因與耐寒性的關系，當溫度降低時，在冷馴化和滯育蛹的腦、中腸和馬爾皮吉亞小管中，mRNA中的Δ9基因表達上調了2～10倍，這與增強耐寒性存在很明顯的相關性[13]，這也表明了昆蟲的耐寒性與FAD9的緊密關系，當受到外界低溫刺激時，昆蟲FAD9基因表達上升以此增強自身抗寒能力，由此逐漸開始了從FADs家族研究昆蟲抗寒能力。目前，已有許多在昆蟲耐寒性方面的研究表明其耐寒性與脂肪酸△9去飽和酶基因存在聯系。對紅尾肉蠅滯育相關基因進行分析時，同樣發現了脂肪酸△9去飽和酶基因表達量呈上升趨勢[14]；利用qPCR技術對滯育時期白紋伊蚊進行分析，發現在低溫下滯育6 d后的FAD9基因是未滯育的FAD9基因表達量的1.8倍[15]；在對彈尾目跳蟲耐寒性的研究中發現，5℃下48 h后，FAD9基因表達量上升了5倍，這些均表明了昆蟲通過增加FAD9基因表達量來提高不飽和脂肪酸含量，進而提升其耐寒性[16]。【本研究切入點】研究該基因序列隆鑒定后進行生物信息學。【擬解決的關鍵問題】對該基因在3種不同蟲態下的表達量進行研究，分析香梨優斑螟在變態發育過程中的不同階段該基因的表達。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蟲源

采集阿拉爾市塔里木大學校園內梨園香梨優斑螟老熟幼蟲，實驗室內待其化蛹、羽化，所得幼蟲、蛹和成蟲，分別用液氮處理后-80℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取為TRIzon總RNA提取試劑，反轉錄試劑盒為 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix，用于PCR擴增的Taq酶均購自康為世紀公司；用于PCR擴增的dNTP Mixture (10 mM)，熒光定量試劑SGExcel UltraSYBR Master 預混液均購自上海生工生物(工程)有限公司；克隆試劑盒pMDTM19-T Vector Cloning Kit購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；克隆感受態細胞Trans5α Chemically Competent Cell和瓊脂糖凝膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自北京全式金生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 香梨優斑螟FAD9基因擴增、克隆

1.2.1.1 總RNA提取與cDNA合成

采用TRIzon總RNA提取試劑提取RNA，并用核酸檢測儀(NanoDrop 2000，Thermo公司)檢測RNA樣品質量濃度。按照 HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix 試劑盒步驟去除總RNA中少量基因組DNA，并以1.0 μg總RNA為模板合成cDNA，稀釋10倍后-20℃保存。

1.2.1.2EpFAD9簡并引物設計、擴增與克隆

在NCBI數據庫搜索FAD9基因編碼蛋白序列，選取甘藍夜蛾ABX90048.1、小地老虎AGR49311.1、美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)AAF81790.2、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)AAL27034.1、紅帶卷蛾(Argyrotaenia velutinana)AAF44709.1、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)AAB92583.1、蘋淡褐卷蛾AAL35750.1氨基酸序列，然后提交到CODEHOP 服務器設計簡并引物，挑選出3對引物由上海生工合成。擴增程序為：預變性 94℃ 3 min ；變性 95℃ 30 s，復性 54℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，共34個循環；終延伸10 min。利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR產物，連接至 pMD19-T Vector 載體，轉化感受態大腸桿菌細胞，培養12～16 h后挑取單克隆菌進行菌液PCR驗證，選取理想目標菌液，送上海生工測序測序。

1.2.2 熒光定量

1.2.2.1 總RNA提取與cDNA合成

幼蟲、蛹和成蟲每個蟲態各3只，提取方法與cDNA合成同3.3.1。

1.2.2.2EpFAD9熒光定量引物設計與qPCR

利用Primer Premier 5.0軟件，根據EpFAD9已知序列設計特異引物，以香梨優斑螟18 s內參基因為對照基因[17]，引物由上海生工合成，qPCR反應采用熒光染料 SYBR GreenⅠ，根據SGExcel UltraSYBR Master試劑盒說明書要求，使用10 μL體系，在Mastercycler ep realplex中進行擴增，PCR程序采用3步法，條件為：95℃ 3 min(預變性)，95℃ 15 s(變性)，56℃ 20 s(退火)，72℃ 25 s(延伸)， 40個循環；熔解曲線：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 EpFAD9基因定量引物Table 1 Real-time PCR primers of EpFAD9 Gene

1.3 數據處理

利用NCBI的ORF Finder工具推測序列的蛋白質氨基酸序列；BLAST搜索同源性序列，用MEGA軟件分析蛋白質氨基酸序列，構建系統進化樹；并用Protparam軟件(https://web.expasy.org/ protparam/)對蛋白進行理化性質分析；利用SignalP 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析該蛋白信號肽；TMHMM Server v2.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析預測的蛋白跨膜結構；用ProtScale軟件(https://web.expasy.org/protscale/)預測該蛋白親疏水性；用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_sopma.html)分析蛋白二級結構；利用SWISS-MODEL(https://www.swissmo-del.expasy.org/)中的自動方式(automated mode)進行同源建模，預測蛋白的三維結構；用NetPhos 3.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)分析EpFAD9蛋白潛在磷酸化位點；用PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/ form2.html)工具預測該蛋白產物的亞細胞定位；EpFAD9基因在不同蟲態的相對表達分析采用相對定量法(2-△△CT法)計算[18]。

2 結果與分析

2.1 EpFAD9基因克隆

總RNA提取結果經檢測OD260/280與OD260/230比值均在1.9～2.0，簡并引物使用普通PCR擴增方法篩選后合適引物為EpFAD9F：5'-CGACCCTATCCTGAGATTCCAGAARAARTAYTA-3'，EpFAD9R：5'-GCCTTCTCCGAGCGRAARAARTA-3'，利用該簡并引物擴增的產物克隆測序后得到一段長為268 bp的核酸序列，通過對該實驗室香梨優斑螟轉錄組測序數據庫的比對，發現1條3 822 bp的此基因序列，并包含了完整開放閱讀框，分析了基因的蛋白特性等信息。

2.2 EpFAD9基因生物信息學

2.2.1 蛋白特性

該基因的開放閱讀框長度為1 056 bp，編碼352個氨基酸，起始密碼子位于序列第1 280堿基ATG，終止密碼子位于序列第2 338堿基TAA。圖1

注：灰色表示FAD9的起始密碼子ATG和終止密碼子TAA
Note:Grey indicates the initiation codoni ATG and termination codon TAA ofFAD9

圖1 香梨優斑螟FAD9基因序列和推導的氨基酸序列
Fig.1 Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences ofEuzopherapyriellaFAD9

對EpFAD9推測氨基酸序列的分子式為C1895H2800N496O496S7，原子總數5 694，相對分子量為40 690.52 u；理論等電點是9.09，呈堿性；帶負電殘基(Asp + Glu)總數為32，帶正電殘基(Arg + Lys)總數為38。

該蛋白共由20種氨基酸組成，丙氨酸(Ala)最多，有35個占總數的9.9%，其次為亮氨酸(Leu)，有31個，占總數的8.8%，含量最少的是半胱氨酸(Cys)，只有1個，占總數的0.3%，沒有吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec)。表2

2.2.2EpFAD9系統發育樹的構建及同源性

將EpFAD9氨基酸序列在NCBI中進行Blastp分析，結果顯示與煙草天蛾(Manducasexta)相似度達到89%，與蘋淡褐卷蛾(Epiphyaspostvittana)、馬尾松毛蟲(Dendrolimuspunctatus)等其它16個昆蟲物種FAD9相似度都達到了80%以上。

將17個物種FAD9編碼的氨基酸序列利用Mega 7.2的鄰接法NJ(bootstrap檢驗，1 000次重復)聚類分析、構建系統進化樹，香梨優斑螟與煙草天蛾在一分支上，說明其親緣關系最近，與歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)、柞蠶(Antheraeapernyi)等4種昆蟲親緣關系較近，與大頭金蠅(Chrysomyamegacephala)、薔薇斜條卷葉蛾(Choristoneurarosaceana)、平行卷葉蛾(Choristoneuraparallela)和蘋淡褐卷蛾、甘藍夜蛾(Mamestrabrassicae)等幾種夜蛾、卷蛾科的昆蟲關系較遠。圖2

2.2.3EpFAD9蛋白信號肽

EpFAD9蛋白信號肽分析，發現該蛋白最大C分值為0.117、最大Y分值為0.114以及最大S分值為0.131，均小于閾值(0.500)，因此，認為EpFAD9無明顯的信號肽。圖3

圖2 香梨優斑螟及其他昆蟲FAD9氨基酸序列構建的系統進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree construction ofFAD9 amino acid sequence ofEuzopherapyriellaand other insects

圖3EpFAD9基因編碼蛋白信號肽預測
Fig.3 Amino acid composition ofEpFAD9 gene signal peptide prediction

2.2.4EpFAD9蛋白跨膜結構

研究表明,EpFAD9蛋白有4個跨膜螺旋，其位置分別位于第39-61、71-93、186-208和213-235氨基酸序列。圖4

2.2.5EpFAD9蛋白親疏水

研究表明,香梨優斑螟FAD9蛋白中親水性最強的是第34位的天冬酰胺(Asn)和第128位的甲硫氨酸(Met)，疏水性最強的是第48位的丙氨酸(Ala)和第193位的亮氨酸(Leu)，親水性氨基酸總數多于疏水性氨基酸，并且親水性最大值明顯大于疏水性最大值，該蛋白整體為偏向親水性。圖5

2.2.6EpFAD9蛋白結構預測

香梨優斑螟FAD9蛋白二級結構中α-螺旋130個氨基酸所占比例為36.93%，延伸鏈59個氨基酸占比例為16.76%，無規卷曲147個氨基酸占41.76%，β-轉角16個氨基酸所占比例為4.55%。圖6

在預測的香梨優斑螟FAD9蛋白的三維結構建模中，螺旋結構和不規則卷曲結構比例很大，少量延伸鏈狀結構，這也與二級結構的預測結果相吻合。圖7

圖4EpFAD9基因編碼蛋白跨膜結構
Fig.4 Amino acid composition ofEpFAD9 gene transmembrane structure analysis

2.2.7EpFAD9蛋白磷酸化位點

在預測的EpFAD9蛋白中，含有15個絲氨酸(Ser)、21個蘇氨酸 (Thr)、 19個酪氨酸(Tyr)，其中潛在磷酸化位點有7個絲氨酸、7個蘇氨酸和4個酪氨酸。圖8

圖5EpFAD9基因編碼蛋白親疏水性
Fig.5 Amino acid composition ofEpFAD9 gene hydrophilic-hydrophobic analysis

注：A.二級結構分析 B.峰值變化
Note:A.secondary structure analysis B.Peak change

圖6EpFAD9基因編碼蛋白二級結構
Fig.6 Amino acid composition ofEpFAD9 gene secondary structure analysis

圖7EpFAD9基因編碼蛋白三級結構預測
Fig.7 Amino acid composition ofEpFAD9 gene Tertiary structure prediction

2.2.8EpFAD9蛋白亞細胞定位

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。亞細胞定位的預測一般通過算法比較查詢序列中所包含的特征參數與各類相應的亞細胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式作出判斷。

預測EpFAD9編碼產物的亞細胞定位，其分布在內質網的可能性為44.4%，分布在線粒體中的可能性為22.2%，分布在高爾基體的可能性同樣是22.2%。表3

圖8EpFAD9基因編碼蛋白磷酸化位點
Fig.8 Amino acid composition ofEpFAD9 gene phosphorylation site analysis

表3 EpFAD9基因編碼蛋白亞細胞定位Table 3 Amino acid composition of EpFAD9 gene Subcellular localization analysis

2.3 EpFAD9基因表達

利用 qPCR 檢測香梨優斑螟不同蟲態的表達水平，結果顯示，在香梨優斑螟的成蟲和蛹期表達量差異很小，都維持在一個相對較低的水平，但是，該基因在幼蟲期高水平表達，極顯著高于成蟲期和蛹期，相對表達量分別是成蟲期的17.75倍，蛹期的29.59倍。圖9

圖9EpFAD9基因在不同蟲態中的基因相對表達量
Fig.9 Relative expression ofEpFAD9 gene in different insect States

3 討 論

香梨優斑螟以幼蟲越冬，在越冬期間不飽和脂肪酸相對含量均高于越冬前后期，飽和脂肪酸則與之相反，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的相對含量和比例的變化對香梨優斑螟滯育幼蟲越冬起到關鍵作用[19]。而FAD9基因是不飽和脂肪酸合成通路中的首個去飽和酶，它對油酸(C18∶1)及亞油酸(C18∶2)等不飽和脂肪酸合成有重要作用，這2種不和脂肪酸在昆蟲體內占有較大比例，對生物膜流動性有重要作用[20]。昆蟲FAD為膜結合蛋白，序列在兩端保守性低，也是許多生物活性分子如性信息素的前體物質，對多細胞有機體的細胞生物學功能起著重要的維系和調節作用[21]。

EpFAD9基因開放閱讀框長1 056 bp，編碼352個氨基酸，其長度與斜紋夜蛾、海膽卷蛾(Ctenopseustisherana)[22]和小地老虎(Agrotisipsilon)[23]等昆蟲FAD9基因蛋白編碼長度一致，氨基酸組成中丙氨酸最多，有35個占總數的9.9%，不含有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸，在對弓形蟲FAD9基因的研究結果同樣顯示為丙氨酸的含量最高[24]。氨基酸組成與與蛋白折疊息息相關，決定了蛋白質親疏水性，EpFAD9編碼蛋白質為親水性蛋白，推測其包含4個跨膜結構域，與多數真核生物脂肪酸△9去飽和酶基因相同[25-27]，跨膜結構是由跨膜蛋白的效應區域所展現，包括細胞能量交換及物質轉運等多種生物膜功能。磷酸化位點是蛋白翻譯后的重要修飾位點，與信息的識別與傳遞有關，對調節蛋白的功能發揮著重要作用[28]。在對EpFAD9編碼蛋白的預測中顯示有多個磷酸化位點，從而更有利于該蛋白質與機體內其他分子或蛋白相互作用，也表明EpFAD9蛋白質酶活力較強。對EpFAD9蛋白進行亞細胞定位預測發現,其可能在內質網、線粒體、高爾基體發揮其生物學作用，主要存在于內質網上，這一預測結果與在小鼠中研究結論相同[26]。

脂肪酸去飽和酶基因作為合成通路中的關鍵基因，其表達水平高低直接影響昆蟲體內不飽和脂肪酸積累，香梨優斑螟幼蟲狀態下EpFAD9含量遠遠高于蛹和成蟲，說明香梨優斑螟幼蟲時期不飽和脂肪酸的代謝速度遠高于成蟲期和蛹期，可能為變態發育過程準備充足的營養物質[29]。由此推測香梨優斑螟幼蟲抵抗低溫能力更強，這與香梨優斑螟以幼蟲越冬相吻合[30]。蛹和成蟲的FAD9基因表達量相對較低，可能這2種蟲態多以脂肪消耗代謝為主有關。

4 結 論

EpFAD9基因基因在香梨優斑螟不同蟲態下存在表達差異，在幼蟲體內的表達量最高，成蟲和蛹期的表達很低，尤其是蟲蛹，其表達量更低于成蟲，蟲蛹和成蟲狀態下的香梨優斑螟對低溫抵抗能力都低于幼蟲。