一株無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02高產漆酶液體培養基的響應面法優化

謝玉清，代金平，陳 競，王志方，古麗努爾·艾合買提，楊新平，張慧濤，王小武，馮 蕾

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】漆酶最早于1883 年在漆樹的汁液中發現研究表明漆酶廣泛存在于自然界中，如植物、真菌、細菌、動物及昆蟲中[1]。漆酶屬于藍色氧化酶家族，是一種含銅的多酚氧化酶，以分子氧作為最終電子受體，是重要的木質纖維降解酶之一，還能催化降解多種芳香族化合物特別是酚類，因而漆酶作為一種綠色生物催化劑在生物質能源、紙漿生物漂白、染料脫色、廢水處理、食品加工等領域具有廣闊的應用前景[2]。真菌漆酶比細菌漆酶、植物漆酶等具有更好的熱穩定性、金屬離子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工農業及環境領域的應用中得到了較高的關注[3]。大型真菌無柄靈芝菌(G.resinaceum)是漆酶最主要的生產者。真菌漆酶的生產模式包括固態發酵和液體發酵，工業生產基本以液體發酵為主，而高產酶發酵培養基的篩選和優化是工業化生產漆酶的關鍵。漆酶在食品、能源和環保等領域具有重要的應用價值。無柄靈芝菌可以合成分泌包括漆酶在內的多種木質纖維素降解酶，這些酶活性隨著發酵工藝不同而不同，對產酶發酵工藝關鍵影響因素培養基進行篩選優化，對于提高漆酶產量和酶活具有重要意義。【前人研究進展】 陳建軍等[4]對產漆酶黃孢原毛平革菌培養基進行篩選優化，確定乳糖和酵母粉為最佳碳、氮源，使該菌的產酶能力提高了4.7倍。柴新義等[5]采用20 g/L 蔗糖，2 g/L 酵母膏，3.2 g/L K2HPO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O， 3 mg/L SDS，6 mmol/L Cu2+，pH7.0的優化培養基，使有柄樹舌靈芝菌產漆酶活性達到496.18 U/mL，是優化前的12.2倍。【本研究切入點】培養基是發酵工藝優化中的首要條件，試驗在基礎產酶培養基和單因素試驗的基礎上，對無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02產酶培養基的碳、氮源進行了進一步的篩選，利用響應面法優化最佳的產漆酶培養基組合。【擬解決的關鍵問題】研究采用響應面法對大型真菌無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02的產漆酶的液體發酵培養基進行優化研究，并對優化所得的理論最佳條件進行試驗驗證，篩選出高產漆酶的液體培養基配方。獲得高產漆酶的液體發酵培養基的碳、氮源配比，為真菌漆酶的規模化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種

無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02為實驗室保存菌株。

1.1.2 培養基

產酶基礎培養基MF[6-8]：麥麩25 g，葡萄糖10 g，酒石酸銨1.84 g，NaCl 1.0 g、KH2PO42 g，琥珀酸鈉1.18 g， VB110 mg，聚山梨酯-80 0.5 g，微量元素溶液70 mL，加水定容至1 000 mL， pH 調至5.5。

微量元素組成：MgSO4·7H2O 3.0 g、MnSO4·H2O 0.5 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g、CuSO4·7H2O 0.1 g、CaCl2·2H2O 0.1 g、KAl(SO4)2·12H2O 10 mg、H3BO310 mg、NaMnO4·2H2O 10 mg，加水定容至1 000 mL。

1.1.3 酶檢測試劑

0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)，0.5 mmol/L 2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，漆酶(Laccases)。

1.2 方 法

1.2.1 漆酶活力測定

采用ABTS[2,2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]法。反應體系組成為0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0) 1.95 mL、0.5 mmol/L 連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS) 2.00 mL和適當稀釋的酶液50 μL， 28℃啟動反應。并在3 min內連續測定反應液420 nm(ε=3.6×104cm-1mol-1L)處吸光值的增加值。該條件下，每分鐘使1 μmol/L ABTS氧化所需的酶量定義為1個活力單位(U)。

漆酶活力計算公式：漆酶活力(U/L)=(n×△A×106×V1)/(3.6×104×3×V2).

其中：n為酶液稀釋倍數；V1為反應總體積；V2為反應酶液體積；△A為3 min內反應液在420 nm處吸光度的變化值； 3.6×104為ABTS氧化態的摩爾吸光系數(cm-1mol-1L)。

1.2.2 液體培養基的響應面法優化

在MF基礎產酶培養基和單因素試驗基礎上，各選擇兩種最優的碳、氮源進行組合。根據Design-Exper 8 軟件的中心組合設計方法，設計干酪素、麥麩、葡萄糖、酒石酸銨四個因素設計響應面試驗。對生成的響應面三維曲面圖以及等高線圖數據進行分析，根據建立的數學模型，得到優化后的高產漆酶液體培養基。表1

應用 Design-Exper8 軟件的中心組合設計方法[9-11]，進行干酪素(A)、麥麩(B)、葡萄糖(C)、酒石酸銨(D)四因素三水平的響應面試驗設計，共設計出 29 個組合，共有5組中心試驗組，分別是9、16、18，21和29，其余均為非中心試驗組。中心試驗組重復5次，用以估計試驗誤差。

表1 響應面分析因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 響應面設計

研究表明,漆酶產量(Y)對四個因素的二次多項回歸方程為：

Y=-29 167.937 50+1 692.500 00A+11 089.958 33B+13 592.083 33C+376 15.520 83D+3 170.750 00AB-2 089.000 00BC-5 443.12 500BD-1 011.0416 7A2-2 607.791 67B2-2 671.666 67C2-222 18.229 17D2。表2

研究表明，模型P值(P<0.000 1)<0.01極顯著，失擬誤差(0.089 7)>0.05不顯著，即該模型在被研究的整個回歸區域內擬合性較好，該模型比較可靠，能夠對發酵漆酶活性條件進行預測。模型中，一次項D顯著，A極顯著，干酪素、酒石酸銨對無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02產漆酶均具有顯著影響，各因素影響順序分別為干酪素>酒石酸銨>麥麩>葡萄糖。表3

表3 回歸模型的方差Table 3 Variance analysis results of regression model

注：P<0.01，極顯著(**)；P<0.05，顯著(*)
Note:P<0.01，extremely significant(**)；P<0.05 significant(*)

圖1 麥麩和灑石酸銨交互作用下漆酶產量的等高線和響應面
Fig.1 Interaction effect of wheat bran and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

2.2 響應面分析

研究表明,響應值與各參數之間相互作用產生的影響。若彎曲程度大，則表明該因素對漆酶產量的影響越大，相應表現為響應值變化的大小。通過軟件 Design-Expert 8分析，確定最佳培養基為干酪素含量2.5%、麥麩含量1.5%、葡萄糖含量1.0%和酒石酸銨含量0.6%時，相應響應面二次模型預測漆酶活性最大值為16 505U/L。

通過3次平行試驗得到的LZ02菌漆酶活性為15800 U/L，與理論預測值無明顯差異，響應面分析法提供的模型較真實地擬合了實際情況，證明了模型的可靠性。 圖1～4

圖2 葡萄糖和麥麩交互作用下漆酶產量的等高線和響應面
Fig.2 Interaction effect of glucose and wheat bran on the contour and response surface diagram of laccase yield

圖3 葡萄糖和酒石酸銨交互作用下漆酶產量的等高線和響應面
Fig.3 Interaction effect of glucose and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

圖4 干酪素和酒石酸銨交互作用對漆酶產量的等高線和響應面
Fig.4 Interaction effect of casein and ammonium tartrate on the contour and response surface diagram of laccase yield

3 討 論

漆酶是一種分布廣泛的多酚氧化酶，在食品、能源和環保等領域具有重要的應用價值.靈芝菌可以合成分泌包括漆酶在內的多種木質纖維素降解酶，這些酶的活性會隨著發酵工藝的不同而不同，對產酶發酵工藝進行優化，對于提高漆酶產量和酶活具有重要意義[12-14]。

響應面法是一種綜合試驗設計和數學建模的優化方法，可以節約試驗成本，縮短工作時間達到對實驗因素的全面衡量，并可分析各因素之間的交互影響。實驗在單因素的基礎上從多個因素中篩選出主要因素，減少優化試驗次數及工作效率[15]。

4 結 論

培養基是發酵工藝優化中的首要條件，試驗在基礎產酶培養基的基礎上，對無柄靈芝菌(G.resinaceum)LZ02碳氮源進行了進一步的篩選，并利用響應面法優化最佳的產漆酶培養基組為：干酪素2.5%、麥麩1.5%、葡萄糖1.0%和酒石酸銨0.6%，優化之后漆酶活性達到15800 U/L，通過試驗結果驗證，驗證了該預測值的準確性和可靠性。。