茶多酚對H9C2大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用機制

陳立慧，李璐璐

0 引 言

缺血性心肌病在臨床上高發，而溶栓或介入等再灌注治療是目前治療缺血性心肌病的最佳方法，但缺血的心肌細胞在恢復血供后仍會發生心肌細胞損傷加重甚至死亡的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)，導致患者心功能障礙甚至是致死性心律失常[1]。雖然導致心肌細胞IRI的機制復雜，但是氧化應激和炎癥反應在心肌IRI發生和發展中發揮重要作用。茶多酚是一類從茶葉中提取的多酚類復合物，由于其來源廣泛，且使用安全，引起了越來越多的關注和研究[2]。多項研究證實，茶多酚具有強大的抗氧化和抗炎能力，目前已有報道其在降壓、降脂等保護心血管方面具有很好的作用[3]，另有研究表明，茶多酚具有改善胰島素抵抗、抗輻射、抗病毒、抑菌及抗病毒等藥理學作用[4-5]。

本實驗開展時間為2017年12月至2019年3月，我們利用缺氧孵箱和常規孵箱交替模擬缺血再灌注環境培養H9C2大鼠心肌細胞，觀察茶多酚處理后缺氧/復氧損傷細胞的細胞活性，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等氧化還原指標和髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎癥指標含量變化和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路中p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、細胞外調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)和p65表達情況，研究其對心肌缺氧/復氧損傷的保護作用，為心肌IRI的防治提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料茶多酚(中國上海源葉生物科技有限公司)，DMEM培養基(美國Gibco)、胰蛋白酶(美國Gibco)、胎牛血清(美國Gibco)，CCK-8(美國Sigma)，MDA試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒、MPO試劑盒、IL-1β試劑盒、TNF-α試劑盒和IL-6試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品，辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Jackson公司，抗P-P38抗體、抗P38抗體、抗P-ERK抗體、抗ERK1/2抗體、抗P-JNK抗體、抗JNK 抗體、抗P65抗體和抗β-actin抗體購自美國Abcam公司；缺氧孵箱(德國賀氏)，分光光度計(中國蘇州威福光電)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養H9C2大鼠心肌細胞購自中科院上海生命科學研究院，選擇3～8代細胞用做實驗。用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃的常氧細胞培養箱中培養H9C2大鼠心肌細胞，隔天換液。細胞生長至80%時用以實驗[6]。

1.2.2 實驗分組及給藥按照隨機數表法將細胞分為對照組、缺氧/復氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組。經過0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL和8 mg/mL這5個濃度梯度茶多酚的作用，檢測細胞活性發現2 mg/mL和4 mg/mL的茶多酚對H9C2大鼠心肌細胞活性無顯著影響，這與文獻[4-5,7]報道一致。對照組予以上述細胞培養方法，常規孵箱培養H9C2大鼠心肌細胞；缺氧/復氧組利用缺氧孵箱和常規孵箱交替模擬缺血再灌注環境培養H9C2大鼠心肌細胞，具體為：利用缺氧孵箱(氧濃度為3%)培養細胞4 h(模擬細胞缺血狀態)后放入常規孵箱(氧濃度為21%)繼續培養4 h(模擬細胞缺血后再灌注狀態),以此方法建立IRI細胞模型[8-10]。低濃度和高濃度茶多酚組處理H9C2大鼠心肌細胞時，在缺氧孵箱培養H9C2大鼠心肌細胞4 h后，分別更換為含有2 mg/mL和4 mg/mL茶多酚的培養基，放入常規孵箱繼續培養。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活性將H9C2大鼠心肌細胞培養在96孔板中，加入CCK-8反應48 h后用酶標儀檢測各孔吸光度。以對照組的吸光度均值為100%，計算其余各組細胞活性[11]。

1.2.4 氧化應激指標和炎癥指標的檢測按照上述各試劑盒說明，在培養48 h后取各組細胞培養上清或細胞裂解液，加入反應試劑后利用酶標儀檢測不同波長下各樣本的吸光度，以此計算MDA、SOD、CAT、GSH-Px、MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等指標的含量[7]。

1.2.5 免疫印跡檢測蛋白含量按照上述分組在6孔板中培養H9C2大鼠心肌細胞，待到細胞融合度在80%左右時，每孔加入50 μL含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液裂解培養的H9C2大鼠心肌細胞，收集裂解液于離心管中，15 000 r/min低溫離心15 min(有效離心半徑為10 cm)，利用蛋白濃度檢測試劑盒檢測所提取蛋白的濃度，按照1∶3比例混合上樣緩沖液和蛋白，煮沸上述蛋白樣本后進行電泳；每個孔上樣40 μg上述煮沸后的蛋白樣本，以90 V電壓進行電泳，保持30 min后改為120 V，90 min后電泳結束后以250 mA恒流轉膜2 h，隨后利用鹽水緩沖液稀釋的5%的脫脂奶粉封閉液(5 g/100 mL)封閉，隨后按照相應的濃度配制抗體(P-P38、P38、P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK、JNK、P65和β-actin)對醋酸纖維素膜分別進行4 ℃過夜孵育，利用鹽水緩沖液洗膜5 min×3次后利用1∶10 000濃度的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h后進行發光檢測[11]。

2 結 果

2.1 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞活性的影響與對照組相比，缺氧/復氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細胞活性減弱(P<0.05)；與缺氧/復氧組相比，茶多酚組細胞活性增強(P<0.05)，但未恢復到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統計學意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖1。

1：對照組；2：缺氧/復氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復氧組比較，#P<0.05圖1 利用CCK-8法檢測茶多酚對缺氧/復氧后H9C2大鼠心肌細胞活性的影響

2.2 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞氧化應激的影響與對照組相比，缺氧/復氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細胞MDA含量增加(P<0.05)，而SOD、CAT和GSH-Px含量均降低(P<0.05)；與缺氧/復氧組相比，茶多酚組細胞MDA含量降低(P<0.05)，SOD、CAT和GSH-Px含量增加(P<0.05), 但均未恢復到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統計學意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖2。

1：對照組；2：缺氧/復氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復氧組比較，#P<0.05圖2 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞氧化應激的影響

2.3 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞炎癥因子的影響與對照組相比，缺氧/復氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細胞MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6含量均增加(P<0.05)；與缺氧/復氧組相比，茶多酚組細胞MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6含量減少(P<0.05), 但均未恢復到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統計學意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖3。

1：對照組；2：缺氧/復氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組與對照組比較，*P<0.05；與缺氧/復氧組比較，#P<0.05圖3 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞炎癥因子的影響

2.4 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞MAPK/NF-κB通路相關蛋白的影響與對照組相比，缺氧/復氧組、低濃度茶多酚組和高濃度茶多酚組細胞P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達均增加(P<0.05)；與缺氧/復氧組相比，茶多酚組細胞P-P38、P-ERK、P-JNK和P65表達減少(P<0.05), 但均未恢復到對照組水平(P<0.05)；高濃度茶多酚組和低濃度茶多酚組差異無統計學意義(P>0.05)，但茶多酚作用效果具有一定的濃度依賴性。見圖4、圖5。

1：對照組；2：缺氧/復氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組圖4 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞MAPK/NF-κB通路相關蛋白的表達

1：對照組；2：缺氧/復氧組；3：低濃度茶多酚組；4：高濃度茶多酚組對照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與缺氧/復氧組比較，#P<0.05，##P<0.01圖5 茶多酚對缺氧/復氧損傷H9C2大鼠心肌細胞MAPK/NF-κB通路相關蛋白的影響

3 討 論

目前IRI的細胞模型主要是利用耗氧劑連二亞硫酸鈉除去培養液中氧,模擬組織細胞缺血缺氧。現有的IRI細胞模型利用含有連二亞硫酸鈉培養基培養模擬缺血和再灌注的方法處理H9C2大鼠心肌

細胞，但慮到連二亞硫酸鈉作用時只是部分模擬組織細胞的缺氧狀態，并不是真正狀態下的組織細胞缺氧，而是通過抑制細胞內部分呼吸酶模擬缺氧效果，且連二亞硫酸鈉對細胞的毒性作用較強，對細胞活性影響較大[12]。相反，通過缺氧孵箱來模擬缺血再灌注模型可以完全避免上述問題，其通過控制培養細胞過程中的氧氣含量，很好的模擬了缺血狀態對細胞的生物學影響，而且其濃度恒定，操作簡單，容易控制[13]。

IRI能夠激活生物膜的脂質過氧化作用，而MDA可被作為是氧化應激程度的指標；正常情況下，組織內CAT、SOD和GSH-Px發揮著防止細胞過氧化的重要作用，當心肌細胞發生IRI時，氧自由基產生增加，CAT、SOD和GSH-Px等物質和產生的自由基迅速結合而含量急劇減少，故此時細胞的抗氧化能力下降，使得細胞膜等結構發生過氧化損傷，最終導致細胞損傷不可逆，直至細胞死亡，因而CAT、SOD和GSH-Px的活性可以反映細胞清除自由基的能力[14-15]。本實驗結果表明茶多酚能夠降低IRI誘導的H9C2大鼠心肌細胞中MDA含量及增加CAT、SOD和GSH-Px的活性減。本研究和其他一些茶多酚抗氧化的研究相似，Wang等[16]的研究表明茶多酚能夠通過抗氧化作用減輕四氯化碳造成的小鼠肝損傷。Qian等[17]發現茶多酚可以通過其抗氧化作用減輕乙醇造成的胃黏膜損傷。Cong等[18]證實茶多酚可通過其抗氧化及抗凋亡作用抑制原代培養皮層神經元的谷氨酸興奮性毒性。

心肌發生IRI時能夠促進心肌細胞產生和釋放多種炎性介質，包括MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等[14-18]，本實驗結果表明茶多酚能夠降低H9C2大鼠心肌細胞中MPO、IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥因子的含量。本研究和其他一些茶多酚抗炎的研究相似，潘妍霓等[19]研究表明，茶多酚能夠通過TNF-α、NF-κB、IL-1β的表達發揮對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用。沈海濤等[20]發現，茶多酚干預可通過減輕腎臟中氧化應激及炎癥反應對百草枯中毒大鼠腎臟有保護作用。王曉芹等[21]發現，茶多酚可以通過減輕炎癥反應和增強機體抗氧化能力改善大鼠胰島素抵抗。

在組織發生氧化應激及炎癥反應過程中NF-κB和MAPK信號通路可被激活，多種IRI中都已發現p38、JNK、ERK1/2和p65通路激活[22-23]。本實驗中也觀察到相似現象，我們發現H9C2大鼠心肌細胞發生IRI時p38、JNK、ERK1/2和p65通路被激活，而茶多酚能夠有效抑制這些通路的活化，從而發揮抗氧化及抗炎作用，進而發揮對H9C2大鼠心肌細胞IRI的保護作用。

本實驗雖在離體細胞學實驗上觀察到了茶多酚對H9C2大鼠心肌細胞IRI的保護作用，但是尚未進行在體實驗，下一步我們將在體繼續研究茶多酚對心肌IRI的保護作用，為進一步研究心肌IRI的防治提供更為確切的實驗基礎。