關于BCCIP與P53相互作用的研究

劉昱彤

摘?要：BCCIP是一個與BRCA2和p21相互作用的蛋白質，在眾多細胞進程中具有重要作用。p53是一種重要的腫瘤抑制基因，也是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因。本文通過引入P53基因來研究BCCIP抑制腫瘤的生物學功能，驗證BCCIP與P53之間的蛋白相互作用關系。

關鍵詞：轉錄調控;BCCIP;P53;抑癌基因;蛋白質與蛋白質相互作用;表觀遺傳學

BCCIP是一個與BRCA2和p21相互作用的蛋白質。作為一種新近克隆成功的抑癌基因，BCCIP是細胞生存、基因穩定不可缺少的基因，該蛋白在胚胎發育、細胞周期調控、細胞有絲分裂、DNA同源重組（HR）以及保持基因組穩定性等眾多細胞進程中都具有重要作用[1]。截至到目前的研究，在Bio GRID數據庫記錄的BCCIP相互作用蛋白有50多種，功能涉及多種細胞生物學過程，預示著BCCIP蛋白在更多方面的功能還有待進一步研究。有研究表明，BCCIP基因在乳腺癌、腦神經膠質瘤、喉癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、前列腺癌等組織中的表達量均有降低或不表達[2]，提示BCCIP與這些腫瘤的發生相關，也進一步證實了BCCIP可能為一個重要的抑癌基因。

為了進一步探討BCCIP的功能和作用機制，我們將研究BCCIP與P53之間相互作用的關鍵性結構域以揭示BCCIP在腫瘤中發揮的功能。因此，我們引入P53基因來研究BCCIP抑制腫瘤的生物學功能。已有研究證實，BCCIP通過調節p53的轉錄活性，減少p53四聚體的形成，阻止p53與它的靶基因p21和HDM2的增強子結合。目前P53對P21的調控作用已有充分的研究，我們將著重研究BCCIP對P53的調控作用。在前期數據的基礎上，為了進一步闡明BCCIP與P53之間的蛋白相互作用位點，本文擬設計實驗：構建BCCIP的真核和原核的表達載體，通過Co-IP和GST pull down等技術找出BCCIP與P53相結合的具體結構域。

1 材料與設備

1.1 實驗材料

1.1.1 主要化學試劑

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回DNA收試劑盒、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、D2000 plus DNA ladder、DL500 DNA marker、預染蛋白Marker SM0671、胎牛血清。

1.1.2 常用試劑成分

（1）LB液體培養基（1L）：10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，調pH至7.4，高壓蒸汽滅菌。

（2）LB固體培養基（1L）：LB液體培養基中加入15g瓊脂粉。

（3）SOC培養基（1L）：20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，2ml 5M NaCl，2.5ml 1M KCl，10ml 1M MgCl2，10ml 1M MgSO4，20ml 1M葡萄糖。

（4）Amp抗生素：1克Amp，10ml蒸餾水，濃度100mg/ml。

（5）DMEM培養基（1L）：一包粉末DMEM培養基，800ml水，2g NaHCO3，10%血清。

（6）磷酸緩沖體系（PBS）（1L）：NaCl 137mmol/L，KCl 27mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。用濃鹽酸調pH為7.4。

（7）胰酶：0.25g胰酶，100mlPBS，調PH為7.4。

（8）50×TAE buffer（1L）：Tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA（pH 8.0）100ml。

（9）6×loading buffer（DNA電泳）：30mM EDTA，36%（V/V）甘油。

（10）10×濕轉transfer buffer（1L）：Tris 14.4g、甘氨酸3.02g、甲醇100ml。

（11）4×SDS-PAGE Loading Buffer（1L）：量取1M Tris-HCl 10ml，稱取4g SDS，200mgBPB，20ml甘油。

（12）PBS（1L）：1ml雙抗+999ml PBS。

1.2 實驗設備

低溫保存箱、藥品保存箱、-80℃冰箱、-40℃冰箱、PCR儀、恒溫臥式搖床、紫外分光光度計、超聲破碎儀、凝膠成像系統、電泳儀電源、水平電泳槽、迷你離心機、超凈工作臺、垂直混合器、低速離心機、可見光分析燈箱、恒溫培養箱、雙垂直蛋白電泳儀、臺式離心機、電子天平、渦旋混勻器、瓊脂糖凝膠電泳儀、洗片機、超純水機、制冰機、磁力攪拌器、脫色搖床。

2 實驗思路與方法

2.1 實驗研究思路

首先我們根據BCCIP和P53的蛋白結構域特征，分別構建了BCCIP和P53的不同截短真核表達質粒，然后在HCT116細胞中共轉BCCIP和P53的不同截短質粒，通過COIP實驗和免疫印跡檢測技術，確定BCCIP與P53相互作用的具體結構域。而后在HCT116細胞中瞬轉一定量的P53全長表達質粒和梯度劑量的BCCIP全長表達質粒，通過Western blot檢測BCCIP對P53蛋白的穩定性的影響;再用同樣的方法瞬轉不同的截短表達質粒，檢測BCCIP對P53相互作用結構域的穩定性影響，進而揭示BCCIP對P53的調控以及在癌癥中的生物學功能。

2.2 實驗研究方法

2.2.1 質粒構建

（1）設計BCCIP和P53的截短質粒引物，PCR選擇最佳退火溫度。（2）DNA電泳并做膠回收。（3）目的片段連接T載體。（4）大腸桿菌轉化，藍白斑篩選，挑菌。（5）PCR檢測，選擇電泳條帶正確的菌株進行小提。（6）送公司進行測序。（7）將連T的Insert和載體分別進行大切膠回收（先小切進行驗證）。（8）Insert與Vector連接。（9）質粒轉化，挑菌。（10）菌液PCR選取條帶位置正確的菌液進行小提。（11）送公司進行測序。

2.2.2 真核表達質粒Co-IP實驗

（1）在HCT116細胞中共轉BCCIP和P53的表達質粒。（2）瞬轉48小時后收細胞，RIPA裂解液4度裂解6小時。（3）12000rpm，4度，離心1小時，收集裂解后上清。（4）平衡beads，beads與細胞裂解液孵育過夜進行結合。（5）洗脫非特異蛋白，做樣，western blot檢測。

3 實驗結果分析

在細胞周期調控中，目前發現BCCIP通過3個途徑調節p21蛋白;在同源重組修復中，BCCIP除了通過BRCA2-RAD51蛋白通路外，還可能通過p21蛋白參與細胞周期和細胞周期檢查點的調節進而影響同源重組修復[3];在維持基因組穩定性方面，BCCIP下調引起細胞分裂中期染色體斷裂和姐妹染色單體交聯，從而影響細胞的有絲分裂，抑制細胞的增值。

One等[4]發現BCCIPα的161-259氨基酸區域與p21的C端149～164氨基酸和CDK2結合后形成三聚體。BCCIPα的過表達通過增強p21抑制CDK2組蛋白H1激酶活性的能力以達到抑制細胞增殖的目的。Meng等[5]發現在細胞內BCCIPβ與p21相互作用可以抑制細胞的生長，并且p21蛋白下調的細胞阻斷部分其抑制細胞生長的功能。用RNA干擾技術抑制BCCIP基因表達可引起p21蛋白水平下調，并且使HT1080細胞G1/S周期檢查點對電離輻射應答的功能受損。而過表達BCCIPα或BCCIPβ引起p21mRNA水平和蛋白表達的升高，延遲細胞的G1/S期。而增加p21蛋白的穩定性并不會引起BCCIP過表達對P21的影響。p21是p53下游的靶基因，p53是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基腫瘤抑制基因。在所有惡性腫瘤中，該基因有一半以上的概率發生突變。研究者推測p53可能與BCCIP對p21的調節相關，接下來的研究發現沉默p53基因表達后，BCCIP過表達不再引起p21水平升高，說明p53是BCCIP誘導p21表達的關鍵因素[6]。進一步研究發現，BCCIP對p53的轉錄活性起著關鍵的作用，在p53野生型細胞，p53蛋白水平不會因BCCIP蛋白的下調而變化，但是會引起p53轉錄活性的降低，減少p53四聚體的形成，阻止p53與它的靶基因p21和HDM2的增強子結合[7]。

本實驗根據BCCIP和P53的蛋白結構域特征，分別構建了BCCIP和P53的不同截短真核表達質粒;先用帶GFP熒光質粒瞬轉以測其瞬轉效率，證明其瞬轉效率沒有問題，然后在HCT116細胞中，通過瞬轉本實驗構建的質粒。我們檢測到質粒在HCT116細胞中瞬轉均表達，構建成功;再通過CO-IP實驗和免疫印跡檢測技術，驗證了BCCIP與P53之間的蛋白相互作用關系，進一步論證了BCCIP蛋白會影響DNA損傷的重組修復，G1/S細胞周期調控，細胞有絲分裂和基因組穩定性，這些都說明BCCIP與腫瘤的發生和腫瘤的治療有著密不可分的關系。

參考文獻：

[1]邱斌.BCCIP在非小細胞肺癌中的研究[D].北京：中國協和醫科大學，2006.

[2]劉曉霞，劉超英，李曉轅，等.BCCIP在卵巢惡性腫瘤的表達及臨床意義分析[J].中國免疫學雜志，2012（3）：213-216.

[3]Meng X，Liu J，Shen Z.Genomic structure of the human BCCIP gene and its expression in cancer[J].Gene，2003，302（1-2）：139-46.

[4]Ono T，Kitaura H，Ugai H，et al.TOK-1，a novel p21Cip1-binding protein that cooperatively enhances p21-dependent inhibitory activity toward CDK2 kinase[J].J Biol Chem.2000，275（40）：31145-54.

[5]Meng X，Liu J，Shen Z.Inhibition of G1 to S cell cycle progression by BCCIP beta[J].Cell Cycle，2004，3（3）：343-8.

[6]Meng X，Lu H，Shen Z.BCCIP functions through p53 to regulate the expression of p21Waf1/Cip1[J].Cell Cycle，2004，3（11）：1457-62.

[7]Meng X，Yue J，Liu Z，Shen Z.Abrogation of the transactivation activity of p53 by BCCIP down-regulation[J].J Biol Chem，2007，282（3）：1570-6.

基金：吉林大學2019年省級大學生創新創業項目（項目編號：201910183791）