二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法在茶葉銅含量檢測(cè)中的優(yōu)化

李 茜，樊竹青，黃竹珺，李媛媛，胡俊超，李學(xué)玲*

（1.普洱學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000；2.云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000）

作為世界茶源，中國(guó)是世界茶葉種植生產(chǎn)和出口的主要國(guó)家。但近30年來(lái)，部分進(jìn)口國(guó)以保障食品安全為由，對(duì)我國(guó)實(shí)施不合理的綠色貿(mào)易壁壘，成為我國(guó)茶葉對(duì)外貿(mào)易的重要阻礙[1-2]。為打破綠色壁壘，保障茶葉出口貿(mào)易，我國(guó)積極應(yīng)對(duì)，出臺(tái)茶葉的綠色食品標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了銅的限量標(biāo)準(zhǔn)為w（Cu） ≤30mg/kg[3-4]。

目前茶葉中銅含量的測(cè)定多采用原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、紫外分光光度法 (二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法)等方法。原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質(zhì)譜發(fā)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等在科研院所、高校和檢測(cè)機(jī)構(gòu)中使用較普遍，但因儀器設(shè)備昂貴，大多茶葉生產(chǎn)廠家采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法來(lái)完成銅含量檢測(cè)也能滿足要求。其檢測(cè)原理為二乙基二硫代氨基甲酸鈉 (DDTC)與銅在堿性溶液中反應(yīng)，可生成棕黃色絡(luò)合物，用四氯化碳萃取實(shí)現(xiàn)分光光度檢測(cè)。但DDTC與銅所生成的棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中易見光分解，且存在有機(jī)相萃取不完全的情況，降低了檢測(cè)的重復(fù)性和精確度[5-6]。同時(shí)本方法使用的四氯化碳是公認(rèn)的肝臟毒物，可通過(guò)呼吸道、消化道、皮膚吸入中毒，中毒大多表現(xiàn)為麻痹中樞神經(jīng)、損害肝腎、麻醉作用[7]，對(duì)操作人員身體健康具有潛在危害。解決上述問題的關(guān)鍵為增強(qiáng)棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化有機(jī)相萃取步驟。非化工級(jí)聚乙烯醇 (PVA)是一種無(wú)毒害、無(wú)副作用、安全的高分子類非離子表面活性劑。本研究旨在以聚乙烯醇 (PVA)醇羥基為親水基團(tuán)，聚乙烯鏈為親油基團(tuán)，形成膠束，保護(hù)棕黃色Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相體系中穩(wěn)定存在來(lái)優(yōu)化二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法。

1 材料和儀器

1.1 原料

普洱熟茶、普洱生茶、碧螺春、古樹茶、銀芽五種茶葉，購(gòu)于普洱市茶葉貿(mào)易市場(chǎng)。

1.2 試劑

四氯化碳、檸檬酸銨、硫酸、氨水、檸檬酸銨、二乙基二硫代甲酸鈉 (DDTC)、酚紅指示劑、五水合硫酸銅、鎂粉、硝酸鎂、鹽酸、聚乙烯醇(PVA)為分析純。

1.3 儀器

紫外可見光分光光度計(jì) (島津公司，UV-2550)；馬弗爐 (上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠，SX2-4-10)；電子天平 (上海精科天美天平儀器廠，F(xiàn)A3204B)；鼓風(fēng)干燥箱 (上海慧泰儀器制造有限公司，DHG-9245A)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10g茶樣于坩堝內(nèi)，加入1g鎂粉，再加入10%硝酸鎂10mL，小火加熱，炭化至無(wú)煙，在馬弗爐中以550℃灰化5h至無(wú)炭粒。加適量12mol/L HCl溶解并用水定容至100mL，搖勻。

2.2 優(yōu)化法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別取 0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL銅標(biāo)準(zhǔn)使用液 (10mg/mL)于25mL比色管中，加20%檸檬酸銨1.0mL，滴入2滴酚紅指示劑，搖勻，用氨水 (1+1)調(diào)紫粉色至透明無(wú)色，加0.1%DDTC溶液1.0 mL和2%PVA 2.0mL，振搖1min后，靜置3min，以空白液調(diào)零，在紫外分光光度計(jì)440nm處測(cè)樣品吸光值。

2.3 優(yōu)化法樣品測(cè)定

取1.0mL樣品消化液于25mL比色管中，以下同2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算消化液和空白液銅質(zhì)量。

計(jì)算公式如下：

式中：ρ為試樣中銅的質(zhì)量濃度 (mg/L)；A1—測(cè)定用試樣消化液中銅的質(zhì)量 (μg)；A2為試劑空白液中銅的質(zhì)量 (μg)；V1為試樣消化液的總體積(mL)。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系及靈敏度對(duì)比

據(jù)對(duì)比優(yōu)化法和原法工作曲線（如圖1所示）可見，兩種方法均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，優(yōu)化法的R2為0.9998，原法的R2為0.9994，若以吸光度A=0.01為可重現(xiàn)值時(shí)，則原法檢出限為0.0202μg/25 mL，優(yōu)化法檢出限為 0.0042μg/25 mL，優(yōu)化法的靈敏度較原法提高了近5倍。

圖1 優(yōu)化法和原法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)比

取5份茶樣分別加入其銅含量的80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品，用優(yōu)化法和原法進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化法的回收范圍在98.6%～106.7%之間，平均回收率為102.3%，原法的回收范圍在92.4%～101.4%之間，平均回收率為96.2%。由此可見優(yōu)化法回收率高于原法。

3.3 精確度對(duì)比

對(duì)5種不同的茶樣分別用優(yōu)化法和原法平行測(cè)定6次，結(jié)果見表1。根據(jù)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD可知，優(yōu)化法的精密度明顯高于原法。

3.4 銅含量檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

表1 優(yōu)化法和原法精確度對(duì)比

利用優(yōu)化法和原法分別測(cè)定市場(chǎng)取樣的普洱熟茶、普洱春茶、碧螺春、古樹茶、銀芽五個(gè)茶樣的銅含量，結(jié)果如表2所示。對(duì)比兩種方法檢測(cè)茶葉中銅含量可見檢測(cè)數(shù)值相近，但優(yōu)化法靈敏度高于原法。我國(guó)綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)NY 288-2018規(guī)定，綠色茶葉中銅含量的限值是w（Cu） ≤30mg/kg，根據(jù)結(jié)果可知，檢測(cè)的5個(gè)茶樣均符合綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)。

表2 優(yōu)化法與原法中銅含量的對(duì)比

4 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)二乙基二硫代氨基甲酸鈉比色法因儀器簡(jiǎn)便易得，是食品中銅離子檢測(cè)常使用的方式，但是卻存在操作復(fù)雜，利用四氯化碳等有毒試劑，污染環(huán)境，對(duì)人體有毒害性，實(shí)驗(yàn)中指示劑顯色不穩(wěn)定，萃取不完全等缺點(diǎn)。本研究通過(guò)優(yōu)化法和原法的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度、回收率實(shí)驗(yàn)的檢出限和靈敏度以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比較可以證明溶液萃取比色法的優(yōu)化法對(duì)茶樣中銅含量的檢測(cè)更為精確。同時(shí)利用優(yōu)化法和原法分別測(cè)定了市場(chǎng)隨機(jī)采樣中的五種茶葉，檢測(cè)結(jié)果均低于我國(guó)綠色茶葉標(biāo)準(zhǔn)NY 288-2018限量。

優(yōu)化法的溶液萃取比色法是可行的，所以在實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化法的聚乙烯醇 (PVA)可以取代原法的四氯化碳作為Cu(Ⅱ)-DDTC絡(luò)合物在水相中的穩(wěn)定劑，提高了實(shí)驗(yàn)人員的操作安全，符合現(xiàn)代檢測(cè)環(huán)保理念。同時(shí)優(yōu)化法改進(jìn)了原法溶液萃取比色法中存在的顯色絡(luò)合物不穩(wěn)定，銅離子萃取不完全的問題，簡(jiǎn)化了四氯化碳萃取步驟，提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率，為茶葉中銅含量的檢測(cè)提供了新方法。