用復合修飾電極示差脈沖伏安法快速測定葉酸含量

王蘇霞，馬永鈞

（甘肅省生物電化學與環境分析重點實驗室，化學化工學院，西北師范大學，甘肅 蘭州 730070）

葉酸（Folic Acid，FA） 又稱為碟酰谷氨酸，是一種B族水溶性維生素，在一些新鮮水果、蔬菜、肉類食品中含量豐富。但是，游離葉酸的性質極不穩定，在光照或加熱的條件下容易發生分解。人體葉酸攝入不足時會導致一系列疾病，例如巨細胞性貧血、白細胞減少、精神障礙等，亦會增加心臟病發作和中風的可能性。孕婦缺乏葉酸還有可能導致胎兒發育遲緩、神經管缺陷，心血管疾病等胎兒畸形問題[1-2]。因此，建立快速、準確地測定葉酸的分析方法為保障人體健康具有重要的意義[3-4]。

目前，葉酸檢測的方法主要有分光光度法[5]、液相色譜法[6-7]、毛細管電泳法[8]和熒光法[9]和電化學方法[10-11]。然而，除電化學方法外，大多數測定葉酸的方法在實際應用時儀器成本相對較高、分析過程也較為復雜。例如，雖然液相色譜法具有高靈敏度、高選擇性的優點，但在操作過程中，不可避免地要使用大量有機溶劑，且對測試樣需要做一些復雜的預處理。葉酸在電極上既可電氧化又可電還原，Gurira等[12]人討論了葉酸的電化學還原機理及電解質pH值對其伏安性質的影響。Kretzschmar等[13]人采用極譜法，研究了葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸的電還原機理。近年來，由于采用化學修飾電極測定葉酸的過程相對簡單，且方法穩定較好，已被用于食品、藥劑中葉酸含量的測定[14-15]，但測定葉酸的化學修飾工作電極易毒化失活的問題尚未根本解決。

氨基酸中含有的羧基和氨基官能團具有獨特的鰲合和吸附作用，因此應用電化學聚合方法可以將氨基酸聚合到不同電極表面上，制備可用于檢測目標化合物的電化學傳感器[16-17]。近年來，含稀土元素雜金屬氰橋配位聚合物的化學修飾材料被廣泛的用于電化學傳感器，這種聚合物膜修飾電極具有高選擇性、高靈敏度和優異的電催化活性與抗電極毒化失活的能力，對一些生物小分子具有高效的電催化氧化作用[18-19]。因此，本文將聚谷氨酰胺修飾層與CyHMCP材料進行復合修飾，成功制備出一種新型的復合修飾玻碳電極(Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE)，利用該電極對葉酸的電催化氧化活性，建立了一種直接、快速測定實際試樣中葉酸含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學工作站（CHI 760B，上海辰華儀器公司）；酸度計（PB-10，德國賽多利斯儀器有限公司）；磁力攪拌器（85-2，中國國華儀器公司）。電化學實驗均采用三電極測試體系，以直徑為3 mm的修飾或者未修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl（0.1 mol·L-1KCl）為參比電極。

谷氨酰胺（含量≥99%，阿拉丁試劑）；氧化鈥（含量≥99.99%，阿拉丁試劑）；鐵氰化鉀（A.R，經重結晶純化）；三聚氰胺（含量≥99.5%，阿拉丁試劑）；葉酸（FA，含量≥97%,阿拉丁試劑）。其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，所有測試均在室溫條件下進行。標準儲備溶液置于4℃的冰箱冷藏室中保存。

10mmol/L葉酸標準溶液的配置：稱量0.1138g葉酸固體，溶于Na2CO3（C=0.10mol/L）中。1mmol/L和0.1 mmol/L的葉酸標準溶液均由10 mmol/L葉酸溶液用Na2CO3（C=0.05mol/L） 稀釋所得。

1.2 Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE的制備過程

裸玻碳電極 （GCE） 依次用 0.3μm及 0.05 μm的Al2O3懸濁液拋光至鏡面，用麂皮擦拭電極表面殘留Al2O3，再將此電極依次用無水乙醇、去離子水中分別超聲清洗2min，最后用蒸餾水沖洗干凈，備用。

參考文獻方法[20]，先將電極進行預處理。把 GCE放入 10mL磷酸鹽緩沖溶液 （PBS，0.10mol/L，pH=7.0） 中，在1.7V的電位下陽極氧化處理400 s，接著在0～1V范圍內循環掃描20圈后取下電極，將電極表面氧化產生的過量黑色物質用濾紙輕輕擦去，用水沖洗。再參照文獻方法[19,21]，將活化后的GCE置于含2.50μmol/L谷氨酰胺，0.10mol/L PBS緩沖溶液 (pH=9.3)，0.10mol/L Na2SO4的電解質溶液中，在-0.9～2.23V電位區間內循環掃描5圈后取出，用蒸餾水沖洗電極表面。再修飾含鈥雜金屬氰橋配位聚合物膜(Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP)，置于電沉積CyHMCP電鍍液中，用循環伏安模式，在電位區間0.6～-0.32 V，掃速17mV·s-1的條件下，循環掃描4圈。此電鍍液組成為Ho3+(10.0mmol/L，2.25 mL)，三聚氰胺 (10.0mmol/L，1.50mL)，一氯乙酸-氫氧化鈉緩沖溶液 (0.20mol/L，5.0mL，pH1.63)，KNO3(0.5mol/L，0.86mL)，Fe(CN)63+(10.0mmol/L， 0.45mL) ， Fe3+(10.0mmol/L，23.3μL)， WO42-(10.0mmol/L， 0.28 mL)， 曲 通（1.0%，1.4 mL），電鍍完成后將修飾好的電極用二次蒸餾水沖洗干凈、備用。

1.3 實際樣品處理

所需樣品均購買于當地超市。菠菜、芹菜、蘋果等樣品按以下程序進行預處理：將樣品切碎，各稱取25.00g，放入研缽中研磨處理后，置于 50mL水溶液 （組成：50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L硼砂溶液） 中超聲提取 30min，再進行離心分離 (12000r/min，10min)；不同品牌的葉酸片樣品準確稱量后放入研缽中研碎，轉移至50mL比色管中，在加入50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L 硼砂溶液，定容至刻度，超聲提取30min，再離心分離 (12000r/min，10min)，取一定量的上清液進行電化學測定。

1.4 實驗步驟

在10mL比色管中，準確加入0.10mol·L-1PBS 緩沖溶液 (pH=8.0)，0.3mol·L-1的 Na2SO4溶液及一定量的葉酸標準溶液或樣品溶液，用超純水定容，充分搖勻后轉移至石英電解池中，采用三電極體系，用示差脈沖伏安法（DPV），在磁力攪拌的條件下富集50s，停止攪拌后靜止5s，進行電化學實驗。儀器參數設置為：脈沖寬度（60ms），脈沖高度（100mV），脈沖間隔時間（200ms），在0.20～0.90V電位區間記錄示差脈沖伏安圖并讀取葉酸的氧化峰電流值。采用標準加入法進行實際樣品中葉酸含量的定量，以外推負截距值計算待測液中葉酸的含量。

2 結果與討論

2.1 復合修飾電極的穩定性及對葉酸的電催化性能

根據文獻可知，葉酸在裸玻碳電極上幾乎觀察明顯的氧化峰[22-23]，而采用本實驗修飾的新型電極后，用含40.0μmol·L-1葉酸標準樣品溶液連續掃描10次的示差脈沖伏安曲線時，觀察到葉酸具有明顯的伏安響應峰（如圖1所示）。此外，在多次連續掃描過程中所得到葉酸的氧化峰峰形，峰電流值、峰電位值重現性均很好，這說明此復合修飾電極對葉酸的電催化活性及穩定性良好。

圖1 葉酸在修飾電極上連續掃描的示差脈沖伏安圖。

2.2 支持電解質的影響

在測定葉酸時，本文比較了磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、稀硫酸溶液、Tris-HCl緩沖溶液等作為支持電解質時葉酸的伏安行為。實驗發現若其他條件相同時，在稀硫酸電解質溶液中，葉酸會同時出現兩個氧化峰，不便于定量分析。而在Tris-HCl緩沖液電解質中，葉酸的檢測靈敏度、電流響應能力較低。再參照文獻[23]，也觀察到葉酸在堿性條件下化學穩定性優于酸性條件。因此，以含25.0μmol·L-1葉酸標準樣品為測試液，用DPV法考察了PBS緩沖液的濃度和pH值對葉酸電化學響應的影響。由圖2可知，當濃度為0.10mol·L-1，pH=8.0時，葉酸的響應電流值達到最大。所以本方法以PBS為測定葉酸的最佳支持電解質。

圖2 支持電解質濃度 (A)和pH值 (B)對葉酸峰電流的影響。

2.3 葉酸的氧化峰電流與掃速的關系

用線性掃描伏安法 (LSV)研究了葉酸的峰電流與掃描速度 (Ip～v)的關系，如圖3所示，實驗發現當掃描速率在0.05～0.60V/s范圍變化時，隨著掃速的增加，葉酸的氧化峰電位正移，響應電流逐漸增加，符合不可逆電化學氧化反應的特征。葉酸的氧化峰電流與掃速呈良好的正比線性關系 (圖3插圖)，擬合方程為：Ip(μA)=5.074+16.42 v(V/s)，R2=0.9981，這說明在此修飾電極上，葉酸的電催化氧化反應屬于典型的吸附控制過程。

圖3 修飾電極上葉酸標準溶液在不同掃速下的線性掃描伏安曲線（插圖為葉酸氧化峰電流與掃描速率的關系）。

2.4 定量分析葉酸的工作曲線

在最佳實驗條件下，以復合修飾電極工作電極，所記錄葉酸的伏安響應曲線如圖4所示。隨著待測樣品中葉酸濃度的增加，其氧化峰電流也相應增大。實驗數據顯示，在5.00～600μmol·L-1的濃度范圍內，葉酸的氧化峰電流與其濃度呈現良好的線性關系 (見圖4內插圖)，線性回歸方程為 Ip(μA)=-0.04017+0.01159CFA(μmol·L-1)，R2=0.9994；檢出限 (S/N=3) 為 2.0μmol·L-1。此外，在實驗過程中還觀察到葉酸在此復合修飾電極上亦可進行電催化還原，這種現象與聚次甲基藍修飾玻碳電極上葉酸的電還原性質相似[24]。但文獻中采用循環伏安法的陰極峰電流為定量參數，其定量分析葉酸的線性響應范圍只有0.1×10-3～2.9×10-3mol/L狹窄的一個數量級左右。這主要是伴隨電還原過程，葉酸在工作電極上會產生強的不可逆吸附，甚至電極上還有可能發生局部的電聚合作用導致了工作電極被污染、毒化失活，使定量分析工作難以為繼。而本實驗采用葉酸的電氧化峰電流為分析參數就可以避免電極污染問題，使本分析方法應用于實樣測定的準確度得到極大的提高。

圖4 不同濃度葉酸的示差脈沖伏安圖（插圖為葉酸的氧化峰電流和濃度間的標準曲線）

2.5 共存干擾物的影響

以質量濃度為18.0 mg·L-1的葉酸標準樣品為檢測樣，我們考察了加入一些干擾物為測定基底物質對葉酸峰電流的影響。結果證明：若以峰電流值變化幅度小于±5%內為界限，添加80倍的KNO3、NaNO3、NaCl，40 倍的葡萄糖，30 倍的蔗糖，60倍的果糖，20倍的草酸鈉，5倍的L-抗壞血酸，40倍的尿素、淀粉、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，5倍的賴氨酸對葉酸的測定均無明顯影響。這說明限量存在的這些基底干擾物質對檢測葉酸的影響均不大，也證明此復合修飾電極具有良好的選擇性和抗干擾性能。

2.6 實際樣品分析

準確移取一定體積的2.3中所得的待測液，按2.4的步驟，用標準加入法進行葉酸含量的測定。不同樣品中葉酸含量的測定結果如表1所示，其回收率在95.9%～109%。從表1中數據可以得出，三種不同品牌的葉酸片，經過預處理，測得葉酸的含量為其理論值的96.7%～108%，這說明用本方法對葉酸片中葉酸的定量準確、可靠，結果令人滿意。在幾種蔬菜及水果中并未檢測到葉酸，但在進行加標測定實驗中，計算得到實樣的加標回收率能達到95.9%～99.4%，表明此復合修飾電極上的適用性良好，葉酸的檢測也并未受實際樣品中已有復雜基底成分的干擾，本方法的選擇性良好。

表1 藥片和食品中葉酸含量的測定結果及回收率 (n=3)。Table 1 Determination results of folic acid content in the real samples (n=3).

3 結語

本實驗在Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE復合修飾玻碳電極上研究了葉酸的電催化氧化行為，初步解決了用化學修飾工作電極測定葉酸時易毒化失活的問題，據此建立了一種快速、直接測定葉酸片中葉酸含量的新方法，本方法的樣品前處理簡單、電極穩定性好、抗毒化性能強、線性范圍寬，對幾種實際樣品中葉酸含量進行了測定，回收率達到95.9%～109%，測定結果令人滿意。